23-重組DNA技術（基因工程）課件

重組DNA技術（基因工程）基因工程基因工程的風險和倫理學問題23-重組DNA技術（基因工程）基因工程基因工程概述基因工程的相關技術基因工程的工具酶載體基因工程的基本步驟基因工程的應用23-重組DNA技術（基因工程）基因工程的概念

geneticengineering基因工程一般可分為廣義和狹義的兩種。廣義的基因工程包括：整體水平，如生物的有性雜交；細胞水平，如細胞融合；分子水平，染色體工程、基因克隆等。狹義的基因工程即是通常講的基因克隆。目的:

是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并能穩(wěn)定遺傳。23-重組DNA技術（基因工程）基因工程的概念

geneticengineering定義：又稱為重組DNA技術，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細胞，使它們在受體細胞中增殖并表達的一種遺傳學操作?；蚬こ淌遣捎梅肿由飳W、核酸生物化學以及微生物遺傳學的現(xiàn)代方法和手段建立起來的基因操作技術。23-重組DNA技術（基因工程）基因工程重要特征：可把來自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無關系的任何其他受體細胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀某一段DNA可在受體細胞內(nèi)進行復制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能23-重組DNA技術（基因工程）基因工程技術路線DNA片段的取得（目的基因的分離和制備）DNA片段和載體的連接——重組體DNA外源DNA片段引入受體細胞——基因克隆和基因文庫篩選目的克隆基因表達與產(chǎn)物分離23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）基因工程的相關技術核酸的分子雜交聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction):PCR和RT-PCR(reversetranscriptionPCR)23-重組DNA技術（基因工程）核酸的分子雜交

Southernblot-DNANorthernblot-RNAInsituhybridizationFluorescentInsituhybridization23-重組DNA技術（基因工程）Southernblot

23-重組DNA技術（基因工程）Northernblot23-重組DNA技術（基因工程）analysisofBLTRmRNA23-重組DNA技術（基因工程）TracingandAssayingMoleculesInsideCellsInsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.23-重組DNA技術（基因工程）FluorescentInsituhybridization23-重組DNA技術（基因工程）聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)聚合酶鏈式反應是體外快速擴增DNA的方法

PCR反應包括三個步驟：變性(denature)：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈低溫退火(annealing)：兩個引物分別與單鏈DNA互補復性延伸(extension)：在引物的引導及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的這三個步驟稱為一個循環(huán)，PCR反應常有25-35個循環(huán)23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）RT-PCR23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是細菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子的一類酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染限制性酶據(jù)其作用特點，可分為兩類※第Ⅰ類限制性酶每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性※第Ⅱ類限制性酶能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅱ類限制性酶識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對稱序列(palindrome)23-重組DNA技術（基因工程）限制性內(nèi)切核酸酶23-重組DNA技術（基因工程）粘性末端平整末端23-重組DNA技術（基因工程）其它工具酶T4DNA連接酶(ligase)反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase)23-重組DNA技術（基因工程）載體(vector)一個DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(hostcell)，并在其中復制、擴增、克隆出多個拷貝。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等23-重組DNA技術（基因工程）載體DNA分子，需要具備：具復制原點(ori)，在宿主細胞中不僅能獨立地自我復制，而且能帶動攜帶的外源DNA片段一起復制具有多克隆位點(multiplecloningsite,MCS)，而每一種酶的切點只有一個，用于克隆外源DNA片段。這些酶切位點不存在于復制原點或抗性選擇標記基因內(nèi)至少具有一個選擇標記基因，使有或無載體的宿主細胞具有易鑒別的表型易從宿主細胞中回收。較小的相對分子量和較高的拷貝數(shù)安全性23-重組DNA技術（基因工程）載體(vector)的種類細菌質(zhì)粒載體λ噬菌體柯斯質(zhì)粒(cosmid)穿梭載體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）Ti質(zhì)粒23-重組DNA技術（基因工程）細菌質(zhì)粒載體◆質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復制、易分離和導入的環(huán)狀雙鏈DNA分子☆這些質(zhì)粒的適應范圍廣，拷貝數(shù)多。進入宿主細胞復制后，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù)可高達1000個◆早期用于基因工程的載體是經(jīng)遺傳改良的細菌質(zhì)粒，它們僅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段☆現(xiàn)在廣泛使用且商品化的質(zhì)粒，很多都具有重組表型檢測標記，在DNA克隆中根據(jù)宿主細胞的表型即可推知質(zhì)粒是否攜帶外源DNA片段23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）λ噬菌體◆λ噬菌體基因組全長49kb。λ噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細菌及形成噬菌斑的能力◆

λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達載體，在基因庫篩選中，λ噬菌體作載體與細菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽性克隆數(shù)多等特點，現(xiàn)廣泛用于各類基因庫的構建

23-重組DNA技術（基因工程）柯斯質(zhì)粒(cosmid)柯斯質(zhì)粒(cosmid)是利用部分λ噬菌體DNA與部分細菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的具有λ噬菌體的cos序列(12bp)和細菌質(zhì)粒的復制原點。cos序列是噬菌體DNA包裝成噬菌體時所必需的，而質(zhì)粒的復制原點可使柯斯質(zhì)粒在細菌細胞中同普通細菌質(zhì)粒一樣自主復制?？山邮荛L達50kb的外源DNA片段23-重組DNA技術（基因工程）穿梭載體是指能在兩種不同的生物中復制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復制，又能在真核細胞(如酵母)中復制的載體不僅具有細菌質(zhì)粒的復制原點及選擇標記基因，還有真核生物的自主復制序列以及選擇標記性狀，具有多克隆位點穿梭載體23-重組DNA技術（基因工程）酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）23-重組DNA技術（基因工程）根瘤細胞的形成是因為土壤農(nóng)桿菌中存在著一種誘導瘤細胞(tumor-inducing,Ti)的質(zhì)粒，這種質(zhì)粒被稱為Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA,T-DNA)當T-DNA整合到宿主植物細胞的染色體后，就誘導出根瘤，并使根瘤細胞合成冠癭堿(opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和氮源Ti質(zhì)粒23-重組DNA技術（基因工程）基因工程的基本步驟基因的獲得陽性克隆的分析與鑒定目的基因與載體連接(DNA分子重組)目的基因?qū)胧荏w產(chǎn)品表達和純化23-重組DNA技術（基因工程）基因的獲得(一)從基因庫中分離基因◆大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫◆如菌斑雜交法(plaquehybridization)篩選λ噬菌體核基因庫(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因(三)人工合成基因(四)RT-PCR23-重組DNA技術（基因工程）陽性克隆的分析與鑒定限制性酶圖譜23-重組DNA技術（基因工程）陽性克隆的分析與鑒定核酸序列分析23-重組DNA技術（基因工程）目的基因與載體連接(DNA分子重組)23-重組DNA技術（基因工程）DNA分子重組23-重組DNA技術（基因工程）目的基因?qū)胧荏w23-重組DNA技術（基因工程）植物基因工程過程23-重組DNA技術（基因工程）小結23-重組DNA技術（基因工程）在基礎研究中的應用在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的應用在醫(yī)學中的應用：基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物基因工程用于疫苗生產(chǎn)基因工程用于基因治療遺傳疾病診斷RFLP法基因工程的應用23-重組DNA技術（基因工程）在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的應用1.增加農(nóng)作物產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，如增加種子、塊莖的蛋白質(zhì)含量，改變植物蛋白的必需氨基酸比例等2.提高農(nóng)作物抗逆性能如：抗病蟲害、抗旱、抗?jié)?、抗除草劑等性?.提高光合作用效率將是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的一個有效方法4.生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物轉(zhuǎn)變?yōu)槟芡鼍采蚓吖痰芰?，將代替無數(shù)個氮肥廠23-重組DNA技術（基因工程）在農(nóng)業(yè)和工業(yè)上的應用5.增加植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率。植物次生代謝產(chǎn)物構成全世界藥物原料的25%，如治療瘧疾的奎寧、治療白血病的長春新堿、治療高血壓的東莨菪堿、作為麻醉劑的嗎啡等6.運用轉(zhuǎn)基因動物的技術，可培育畜牧業(yè)新品種7.“吃油”工程菌8.纖維素酶23-重組DNA技術（基因工程）不易腐爛的番茄動物植物的遺傳改良抗蟲植物化學農(nóng)藥兔毛棉花在我國培育成功：用兔的一種角蛋白轉(zhuǎn)化棉花，棉花纖維質(zhì)量好，具有兔毛般的光澤23-重組DNA技術（基因工程）抗蟲棉花23-重組DNA技術（基因工程）Swissresearchershaveproducedricecapableofsynthesizingbeta-carotene,theprecursorofVitaminA(Yeetal.,2000).Thisricevarietyisnowbeingcrossedintoadaptedvarieties,withfieldtestspossibleinayearortwo.

Grapevinesaresusceptibletoseveraldiseasesthatreducetheamountandthequalityofwinegrapesandtablegrapesorevenkillthevine.Genesthatconferresistancetoparticulardiseaseswouldreducethecostofbattlingdiseasesinthevineyard.ResearchersattheUniversityofFloridahavepatentedamethodforproducinggrapevinesthatcarryasilkwormgenetoprovideprotectionfromPierce'sdisease,afatalbacterialdiseasethataffectsgrapesandseveralotherplants.23-重組DNA技術（基因工程）Improvednutritionalcontentanddelayedripeningaretransgenictraitsofinterestintomatoes.Source:USDACanolaisamajoroilseedcrop.TransgenicresearchhasfocusedonimprovingthenutritionalqualityofcanolaoilbyenhancingtheVitaminEcontentorbymodifyingthebalanceoffattyacids.Nicotine-freetobaccoisnowbeinggrownforaprojectedintroductionofnicotine-freecigarettes23-重組DNA技術（基因工程）Decaffeinatedcoffeeisnowmadebytreatingcoffeebeanstoremovethecaffeine.Othermethodsarecriticizedforremovingsomeofthedesirable,flavor-producingcomponentsalongwiththeundesirablecaffeine.PapayaisatropicalfruitrichinVitaminsAandC,butsusceptibletoanumberofseriouspestsanddiseases.ThetransgenicvarietyUHRainbow,resistanttothepapayaringspotvirus,iscurrentlyinproductioninHawaii.23-重組DNA技術（基因工程）Foodcropsengineeredtoproduceediblevaccinesagainstinfectiousdiseaseswouldmakevaccinationmorereadilyavailabletochildrenaroundtheworld.Whitemold(Sclerotinia)isaseriousproblemforsunflowerproducersinsomeareas.Resistancetothisdiseasewouldexpandtheareainwhichsunflowerscanbegrownandmightimproveyieldsinareasofcurrentcultivation.23-重組DNA技術（基因工程）Transgenicmice,10weeks,44gand29g轉(zhuǎn)基因動物23-重組DNA技術（基因工程）人胰島素:從豬和牛的胰臟提取，獲得100g胰島素需800-1000kg的牛胰臟?，F(xiàn)在用基因工程方法在大腸桿菌中表達產(chǎn)生人生長激素:具有物種特異性，只能用人的生長激素來治療侏儒癥。以前從尸體腦垂體中提取，來源非常有限，現(xiàn)在用基因工程方法在大腸桿菌中表達產(chǎn)生干擾素:體外培養(yǎng)人體細胞來生產(chǎn)，產(chǎn)量低，成本高，現(xiàn)用重組大腸桿菌生產(chǎn)在醫(yī)學中的應用23-重組DNA技術（基因工程）23-重組DNA技術（基因工程）基因工程用于疫苗生產(chǎn)常用的制備疫苗的方法，一種是弱毒活疫苗，一種是死疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點?；钜呙珉[含著感染的危險性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接種利用基因工程