擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BADH基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化煙草的研究

擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BADH基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化煙草的研究擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BADH基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化煙草的研究

摘要：本文旨在構(gòu)建擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BETNEALDEHYDEDEHYDROGENASE(BADH)基因植物表達(dá)載體，并進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行功能研究。通過(guò)PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶切割，得到rd29A啟動(dòng)子和BADH基因的片段，將其連接形成表達(dá)載體?；诶ハx(chóng)植物轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)載體導(dǎo)入煙草愈傷組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)PCR、南方雜交和RT-qPCR等分子生物學(xué)分析方法的應(yīng)用，對(duì)轉(zhuǎn)化后的煙草進(jìn)行了鑒定和酶活性測(cè)定，結(jié)果表明rd29A啟動(dòng)子成功啟動(dòng)了BADH基因的表達(dá)，增加了BADH的酶活性。研究結(jié)果表明該構(gòu)建的載體成功驅(qū)動(dòng)了BADH基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)，為后續(xù)的耐逆性和抗逆性研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬南芥rd29A啟動(dòng)子；BADH基因；表達(dá)載體；煙草；轉(zhuǎn)基因；功能研究

一、引言

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到各種內(nèi)外因素的影響，其中干旱、鹽堿脅迫是限制植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要因素之一。羧醛醛脫氫酶(BADH)，即BETNEALDEHYDEDEHYDROGENASE，是在甜菜堿(Betaine)生物合成代謝過(guò)程中起重要作用的關(guān)鍵酶。BADH酶能催化乙醛和NADP+生成甜菜堿，并將乙醛氧化為乙酸，發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)解毒作用。甜菜堿能夠提高植物細(xì)胞的滲透壓，防止細(xì)胞脫水和離子紊亂，從而增強(qiáng)植物對(duì)干旱、高鹽和低溫等逆境的耐受性。

為了進(jìn)一步研究BADH基因在植物中的功能，需要將其成功導(dǎo)入植物基因組，并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)。本研究選擇了擬南芥rd29A啟動(dòng)子，這是一種脅迫響應(yīng)元件，能夠在干旱和高鹽等逆境條件下驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。煙草作為常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街参?，容易?shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化和功能研究，因此本研究以煙草為目標(biāo)植物，構(gòu)建了擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BADH基因表達(dá)載體，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和功能研究。

二、材料與方法

2.1rd29A啟動(dòng)子和BADH基因片段的擴(kuò)增和連接

從擬南芥基因組中提取DNA，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到rd29A啟動(dòng)子和BADH基因片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)35次；最終72℃延伸10min。通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割，連接兩個(gè)片段。

2.2構(gòu)建表達(dá)載體

將連接好的rd29A啟動(dòng)子和BADH基因片段插入表達(dá)載體中。表達(dá)載體經(jīng)過(guò)酶切后，與目標(biāo)片段連接形成完整載體。通過(guò)酶切酶判斷連接是否成功，并進(jìn)行DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3煙草遺傳轉(zhuǎn)化和篩選

將獲得的表達(dá)載體通過(guò)昆蟲(chóng)植物轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入煙草愈傷組織中。將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR對(duì)植株進(jìn)行鑒定。

2.4分子生物學(xué)分析

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR、南方雜交和RT-qPCR等分子生物學(xué)分析方法進(jìn)行鑒定和酶活性測(cè)定。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中BADH基因是否成功表達(dá)和產(chǎn)生激活的BADH酶。

三、結(jié)果和討論

通過(guò)PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶切割，得到了rd29A啟動(dòng)子和BADH基因的片段，并成功連接成表達(dá)載體。構(gòu)建好的表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證連接正確。通過(guò)昆蟲(chóng)植物轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體導(dǎo)入煙草愈傷組織中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和篩選獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

通過(guò)PCR、南方雜交和RT-qPCR等分子生物學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，rd29A啟動(dòng)子成功啟動(dòng)了BADH基因的表達(dá)，表明轉(zhuǎn)基因煙草中成功產(chǎn)生了BADH蛋白。

進(jìn)一步通過(guò)酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草中BADH酶的活性明顯增加。這表明rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了BADH基因的表達(dá)，成功提高了BADH酶的酶活性。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BADH基因植物表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行了功能研究。結(jié)果表明rd29A啟動(dòng)子成功啟動(dòng)了BADH基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)，增加了BADH的酶活性。這為后續(xù)的耐逆性和抗逆性研究奠定了基礎(chǔ)。

研究的局限性在于僅在煙草中進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因和功能研究，對(duì)其他作物的應(yīng)用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，BADH基因的功能研究仍然只是初步階段，需要進(jìn)一步的深入研究，為作物的逆境抗性育種提供理論及技術(shù)支持。

本研究成功構(gòu)建了擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BADH基因植物表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行了功能研究。結(jié)果顯示，rd29A啟動(dòng)子成功啟動(dòng)了BADH基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)，增加了BADH的酶活性。這為后續(xù)的耐逆性和抗逆性研究提