第六章酶工程制藥

第六章酶工程制藥本章內(nèi)容概述酶的來源和生產(chǎn)酶和細胞的固定化固定化酶和固定化細胞的反應(yīng)器酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用酶工程研究的進展2一、概述酶的特性：酶是生物催化劑，大多數(shù)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸。酶除具有一般催化劑的共性外，還有其特有的特點：催化效率高；專一性強；反應(yīng)條件溫和；酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。3酶的分類1961年按酶所催化的反應(yīng)類型將酶分成6大類：

氧化還原酶類；轉(zhuǎn)移酶類；水解酶類；裂合酶類；異構(gòu)酶類；合成酶（或稱連接酶）類。4什么是酶工程？酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合、發(fā)展而形成的一門新的技術(shù)科學(xué)。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。5酶工程學(xué)的發(fā)展歷程20世紀20年代初：酶工程名稱出現(xiàn)于自然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用；1953年，羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹脂進行固定。1969年，固定化酶技術(shù)拆分DL-氨基酸1971年，1st國際酶工程會議：酶的生產(chǎn)、分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應(yīng)器、酶及固定化酶的應(yīng)用等。6現(xiàn)代酶工程的研究內(nèi)容

從現(xiàn)代觀點來看，酶工程主要有以下幾個方面的研究內(nèi)容：酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應(yīng)用開發(fā)；酶和細胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究（包括酶傳感器、反應(yīng)檢測等）；酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶（突變酶）的研究；7現(xiàn)代酶工程的研究內(nèi)容酶的分子改造與化學(xué)修飾、以及酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究；有機相中酶反應(yīng)的研究；酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)及應(yīng)用研究；抗體酶、核酸酶的研究；模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成的研究。8二、酶的來源和生產(chǎn)酶的來源：酶普遍存在于生物體中，可直接從生物體中分離。化學(xué)合成方法目前還不成熟。早期是以動植物為原料進行提取，由于動植物生長周期長、來源有限、受地理、氣候和季節(jié)等因素的影響，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。目前工業(yè)化生產(chǎn)一般以微生物為主要來源。9微生物生產(chǎn)酶的優(yōu)點微生物種類繁多，動植物體內(nèi)的酶在微生物中幾乎都可以找到；繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡便、并可以通過控制培養(yǎng)條件來提高產(chǎn)量；微生物具有較強的適應(yīng)性，通過各種遺傳變異手段能培育出新的高產(chǎn)菌株。10酶的生產(chǎn)菌

對菌種的要求：1、產(chǎn)酶量、酶的性質(zhì)、最好是胞外酶；2、不是致病菌；3、穩(wěn)定，不易產(chǎn)生變異退化，不易感染噬菌體；4、能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。11生產(chǎn)菌的來源菌種保藏機構(gòu)、有關(guān)研究部門獲得；從自然界中分離篩選（土壤、深海、溫泉、火山、森林都是菌種采集地），篩選包括菌樣采集、菌種分離、初篩、純化、復(fù)篩、生產(chǎn)性能鑒定。生產(chǎn)菌的改良，基因突變、基因轉(zhuǎn)移、基因克隆。12常用產(chǎn)酶微生物

大腸桿菌：一般屬于胞內(nèi)酶，需要經(jīng)過細胞破碎才能得到。工業(yè)上用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、芐青霉素?；浮?-半乳糖苷酶等。枯草桿菌：a-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸脂酶。青霉菌：葡萄糖氧化酶、青霉素?；?、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶等。13常用產(chǎn)酶微生物黑曲霉：有胞外酶和胞內(nèi)酶，糖化酶、a-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶。米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲中得到廣泛應(yīng)用。木霉：纖維素酶，含有較強的17a-羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。根霉：糖化酶、a-淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶，含有較強的11a-羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。14常用產(chǎn)酶微生物鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，含有豐富的11a-羥化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化。啤酒酵母：釀造啤酒、酒精、飲料酒和面包制造?？缮a(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶等的生產(chǎn)。植物細胞：大蒜-超氧化物歧化酶、木瓜-木瓜蛋白酶、菠蘿-菠蘿蛋白酶。15三、酶和細胞的固定化酶反應(yīng)幾乎都在水溶液中進行，屬均相反應(yīng)，自然簡便，但缺點是游離酶只能一次性使用，不僅造成酶的浪費，而且會增加產(chǎn)品分離的難度和費用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量；另外溶液酶很不穩(wěn)定，容易變性和失活。16酶和細胞的固定化將酶制劑制成既能保持其原有的催化活性、性能穩(wěn)定、又不溶于水的固形物，即固定化酶，則可象一般固定催化劑那樣使用和處理，就可以大大提高酶的利用率。與酶類似，細胞也能固定化，固定化細胞既有細胞特性和生物催化的特性，也具有固相催化劑的特點。17什么是固定化酶？固定化酶：限制或固定于特定空間位置的酶，即經(jīng)物理化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。18

19固定化酶的特點可以多次使用，而且在多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性提高反映后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；反映條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少；比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。缺點：固定化處理過程中酶的失活。20固定化細胞

將細胞限制或定位于特定空間位置的方法。特點：無需進行酶的分離純化；細胞保持酶的原始狀態(tài)，固定化工程中酶的回收率高；固定化酶比細胞內(nèi)酶穩(wěn)定性高；細胞內(nèi)酶的輔因子可自動再生；細胞本身含多酶體系，可催化一系列反應(yīng)；抗污染能力強。21酶和細胞的固定化方法酶的固定化就是通過載體將酶限制或固定于特定的空間位置，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。由于酶的空間結(jié)構(gòu)、活性位點等物理化學(xué)特性不同，因此并不是一種固定化技術(shù)就能普遍適用于每一種酶，所以要根據(jù)酶的應(yīng)用目的和特性，來選擇其固定化方法。22酶和細胞的固定化方法目前已建立的各種各樣的固定化方法，按所用的載體和操作方法的差異，一般可分為：載體結(jié)合法；包埋法；交聯(lián)法；細胞固定化還有選擇性熱變性（熱處理）方法。23

酶和細胞的固定化方法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型物理吸附法離子結(jié)合法共價結(jié)合法熱處理（細胞）24載體結(jié)合法載體結(jié)合法是將酶結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法。常用的結(jié)合方法：物理吸附法離子結(jié)合法共價結(jié)合法25物理吸附法用物理方法將酶吸附于不溶性載體上。此類載體有無機載體、天然高分子、大孔型合成樹脂、疏水型的載體。缺點在于最適吸附酶量無規(guī)律可循，不同載體和不同酶其吸附條件也不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系，同時酶與載體之間的結(jié)合力不強，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物。此法也可固定細胞26離子結(jié)合法是通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上的固定化方法。此類載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂，如DEAE-纖維素、AmberliteCG-50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。操作簡單、酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。但是載體與酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或vpH的影響，在離子強度高的條件下進行反應(yīng)時，往往會發(fā)生酶從載體上脫落的現(xiàn)象。此法也可用于微生物細胞的固定化，細胞有自溶現(xiàn)象。27共價結(jié)合法酶以共價鍵結(jié)合于載體上。將酶分子上非活性部位功能團與載體表面反應(yīng)基團進行共價結(jié)合的方法。是研究最廣泛、內(nèi)容最豐富的固定化方法。原理是酶分子上的功能團，如氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基等和載體表面的反應(yīng)基團之間形成共價鍵，因而將酶固定在載體上。共價結(jié)合法有數(shù)十種，如重氮化、迭氮化、酸酐活化法、酰氯法、異硫氰酸酯法、縮合劑法、溴化氰活化法、烷基化及硅烷化法等。28共價結(jié)合法的優(yōu)缺點共價結(jié)合法與離子結(jié)合法和物理吸附法相比，反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜。由于采用了比較強烈的反應(yīng)條件，會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化，破壞部分活性中心。因此往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的底物專一性等性質(zhì)也會發(fā)生變化。但是酶與載體結(jié)合牢固，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。29共價偶聯(lián)法30交聯(lián)法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細胞與細胞之間交聯(lián)的固定化方法。交聯(lián)法有可分為交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法及載體交聯(lián)法4種。反應(yīng)條件比較強烈，固定化酶的酶活回收一般較低，但是盡可能降低交聯(lián)劑的濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶比活的提高。31交聯(lián)方式最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它的二個醛基與酶分子的游離氨基反應(yīng)形成schiff堿，彼此交聯(lián)。32常用于固定化酶的交聯(lián)劑33包埋法包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型兩種。將酶或細胞包埋在高分子凝膠網(wǎng)絡(luò)中的稱為網(wǎng)格型；將酶或細胞包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。包埋法注意事項：防止高分子聚合造成酶的失活，只適于小分子底物和產(chǎn)物。34包埋法網(wǎng)格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等合成高分子和淀粉、明膠、膠原、海藻膠和角叉菜膠等天然高分子。網(wǎng)格型包埋法是固定化細胞中用得最多、最有效的方法。由包埋法制得的微囊型固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體，顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物與產(chǎn)物的擴散，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。35微囊型36

37選擇性熱變性法專用于細胞固定化。是將細胞在適當(dāng)溫度下處理使細胞膜蛋白變性但不使酶變形而使酶固定于細胞內(nèi)的方法。38固定化細胞39固定化細胞的特點40固定化酶制備技術(shù)41固定化酶制備技術(shù)42固定化細胞制備技術(shù)43固定化方法的選擇依據(jù)固定化酶應(yīng)用的安全性：主要是指固定化過程中應(yīng)用的試劑是否有毒性和殘留。固定化酶在操作中的穩(wěn)定性：主要從酶活和穩(wěn)定性方面考慮，選擇折中的條件。固定化的成本：應(yīng)盡可能降低成本。44載體選擇的依據(jù)一般是為了工業(yè)化生產(chǎn)，因此性能好、價格便宜是一項重要的指標(biāo)；此外，底物或產(chǎn)物性質(zhì)都是重要的考慮對象。45常用的酶和細胞固定化載體46固定化方法及其特性比較47固定化酶的形狀目前已有多種物理形狀的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纖維、微囊和顆粒狀的固定化酶。固定化酶的物理形狀不僅是為了適應(yīng)不同的應(yīng)用目的及反應(yīng)類型而制備相應(yīng)形狀，其最終形狀還與基質(zhì)的性質(zhì)和制備方法有關(guān)。48固定化酶的形狀49固定化酶的形狀50酶固定化后的性質(zhì)天然酶經(jīng)過固定化后即成為固定化酶，其催化反應(yīng)體系也由均相反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷喾磻?yīng)。由于固定化方法和所用載體性質(zhì)不同，制備的固定化酶可能會受到擴散控制、空間障礙、微環(huán)境變化和化學(xué)修飾等因素的影響，可能會導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)和酶活力的變化。51酶活力的變化一般酶活力下降?？紤]相應(yīng)的固定化過程可能對酶的影響，避免損害酶的活性中心，有時在固定化反應(yīng)體系中會加入抑制劑、底物或產(chǎn)物以保護酶的活性中心。乳糖酶的固定化就采用在其抑制劑葡萄糖--內(nèi)酯存在下進行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，如此可獲得高活力的固定化乳糖酶。52酶穩(wěn)定性的變化53酶穩(wěn)定性的變化54酶學(xué)特性的變化55固定化細胞的形狀和性質(zhì)固定化細胞的形狀：與固定化酶一樣，可以具有珠狀、塊狀、片狀或纖維狀等。工業(yè)上應(yīng)用較多的是包埋法制備的各種形狀的固定化細胞。固定化細胞的性質(zhì)：一般是利用其胞內(nèi)酶，底物和產(chǎn)物必需是小分子。固定化細胞的穩(wěn)定性有一定提高。56固定化酶活力的測定方法可用在單位時間內(nèi)，單位體積中的底物減少量或產(chǎn)物增加量來表示，通常在酶促反應(yīng)中，如底物具有光吸收、旋光、電位差或熒光等性質(zhì)的變化，可以進行直接測定。有可通過與酶產(chǎn)物相偶聯(lián)的酶促反應(yīng)來測定活力。57四、固定化酶和固定化細胞的反應(yīng)器反應(yīng)器的類型和特點：用于酶催化反應(yīng)的裝置稱為酶反應(yīng)器，它可用于溶液酶，也可用于固定化酶。分類：間歇式攪拌反應(yīng)器連續(xù)流動攪拌反應(yīng)器填充床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器連續(xù)流動攪拌罐其它有淤漿反應(yīng)器、滴流床反應(yīng)器等。58各類反應(yīng)器示意圖59反應(yīng)器的選擇依據(jù)根據(jù)固定化酶的形狀來選擇根據(jù)底物的物理性質(zhì)來選擇根據(jù)酶反應(yīng)動力學(xué)特性來選擇根據(jù)外界環(huán)境對酶的穩(wěn)定性的影響來選擇根據(jù)操作要求及反應(yīng)器費用來選擇60五、酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

酶工程的優(yōu)點是工藝簡單、效率高、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小、產(chǎn)品收率高、純度好、還可制造出化學(xué)方法無法生產(chǎn)的產(chǎn)品。61酶在疾病預(yù)防和治療方面的應(yīng)用

蛋白酶（臨床上使用最早、用途最廣的藥用酶之一，消化劑、抗炎劑）。a-淀粉酶（消化劑）、脂肪酶（消化劑）。溶菌酶（抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛作用）。超氧化物歧化酶（抗氧化、抗輻射、抗衰老、保護機體的DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜免受超氧負離子的破壞）。乳糖酶（治療乳糖缺乏癥）。蚓激酶、鏈激酶、尿激酶、降纖酶、抗栓酶等。62固定化細胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸

青霉素G經(jīng)青霉素?；缸饔茫獬?cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸，也稱無側(cè)鏈青霉素。6-氨基青霉烷酸是生產(chǎn)半合成青霉素的最基本原料63工藝路線

大腸桿菌的培養(yǎng)

大腸桿菌固定化（菌體加戊二醛形成凝膠后通過粉碎和過篩獲得顆粒狀固定化大腸桿菌細胞）固定化大腸桿菌反應(yīng)堆制備

轉(zhuǎn)化反應(yīng)

6-氨基青霉烷酸的提取

64固定化酶法生產(chǎn)5’-復(fù)合單核苷酸

5’-復(fù)合單核苷酸可用于治療白血球下降、血小板減少以及肝功能失調(diào)等疾病。核糖核酸經(jīng)磷酸二脂酶作用，可分解為腺苷、胞苷、尿苷、鳥苷等一磷酸化合物。該磷酸二脂酶存在于桔青霉細胞、谷氨酸發(fā)酵菌細胞、麥芽根等生物材料中。本法以麥芽根為材料制備磷酸酶。65工藝路線

磷酸二脂酶的制備（干麥芽根）固定化磷酸二脂酶的制備

（吸附法：ABXE-纖維素）轉(zhuǎn)化反應(yīng)

分離純化5’-復(fù)合單核苷酸66六、酶工程研究進展酶的修飾酶的人工模擬有機相的酶反應(yīng)基因工程酶的構(gòu)建67酶的化學(xué)修飾天然酶的缺陷：易于變性失活（酸、堿、有機溶劑、熱）；容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制；工業(yè)反應(yīng)要求的酸度和溫度并不總是在酶反應(yīng)的最適酸度和溫度范圍內(nèi)；底物不溶于水，或酶的米式常數(shù)過高；酶做為藥物在體內(nèi)的半衰期較短等因素限制了酶制劑的應(yīng)用。68化學(xué)修飾對酶在分子水平上用化學(xué)方法進行改造，即在體外將酶分子通過人工方法與一些化學(xué)基團，特別是具有生物相容性的大分子進行共價連接，從而改變酶分子的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。目的：提高酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶分子的免疫原性（醫(yī)藥）。意義:擴大了酶制劑的應(yīng)用范圍，同時化學(xué)修飾法也是研究酶的活性中心性質(zhì)的重要手段。69常用的化學(xué)修飾劑要求：修飾劑具有較大的分子量，良好的生物相溶性和水溶性，分子表面具有較多的反應(yīng)活性基團及修飾后酶活的半衰期較長。常用化學(xué)修飾劑：糖及糖的衍生物（右旋糖苷）；高分子多聚物（聚乙二醇）；生物大分子（肝素）；雙功能試劑（戊二醛）；糖基化試劑等。70修飾方法

修飾酶的功能基團：酶分子中可解離的基團如氨基、羥基、羧基、巰基等都可以修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸的電荷；通過碳二亞胺反應(yīng)，可以改變側(cè)鏈羧基的性質(zhì)；通過?；磻?yīng)可改變側(cè)鏈羥基的性質(zhì)。71修