第一周第一節(jié)

免疫→標記技術(shù)測定袁笑濱醫(yī)附院檢驗科病從口入，嚴格把關(guān)！乙肝五項檢測HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb高效！快速！禽畜疫??；真菌毒素；激動劑類；抗生素；其他：三聚氰胺，蘇丹紅。經(jīng)典標記技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)三大經(jīng)典免疫標記技術(shù)酶標記技術(shù)的催生1941，Coons，熒光標記免疫技術(shù)1956，Berson&Yalow，放射標記免疫技術(shù)1966年，Nakane&Pierce，“酶標抗體：制備和應(yīng)用于抗原的定位”20世紀70年代，酶標記檢測技術(shù)飛速發(fā)展酶免疫技術(shù)原理及特點抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性底物

E酶標抗體EE抗原

是以酶標記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)能定性、定位、定量原理及特點原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析

特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測定技術(shù)均相酶免疫測定非均相酶免疫測定酶放大免疫測定技術(shù)液相酶免疫測定固相酶免疫測定：酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)組織切片或其它標本中抗原的定位分析

液體標本中抗原或抗體的定性和定量酶免疫分析技術(shù)分類主要內(nèi)容第一節(jié)酶標記技術(shù)第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附實驗第三節(jié)其他酶免疫測定技術(shù)

第四節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)

第五節(jié)酶免疫分析技術(shù)案例一、酶標記技術(shù)（一）酶和酶作用底物（二）酶標記抗體或抗原1.標記酶的特點1.自然界分步廣泛，易純化。2.性質(zhì)穩(wěn)定，比活高。3.酶結(jié)合物穩(wěn)定，便于觀察和保存實驗結(jié)果。4.酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量。5.方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行。6.酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉。2.常用于酶免疫技術(shù)的酶辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase,HPR）堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase)β–半乳糖苷酶（β-Gal）酸性磷酸酶葡萄糖過氧化酶溶菌酶3.酶和酶作用底物RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比-糖蛋白（主酶）-亞鐵血紅素（輔基）-主酶與酶活性無關(guān)-輔基是酶的活性中心酶活（高比活性）：RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要.底物為H2O2：催化物無色還原型染料生成有色氧化型染料

辣根過氧化物酶3.酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（HRP）的底物

DH2+H2O2D+2H2O

HRPH2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

3.酶和酶作用底物-2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽。---TMB反應(yīng)后顯藍色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色，測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。---OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。辣根過氧化物酶HRP5-氨基水楊酸5-ASA鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMBABTSHRP常用底物3.酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP）β–半乳糖苷酶（β-Gal）性質(zhì)：磷酸酯水解酶；底物：催化磷酸化合物（單酯、核苷、糖）水解釋放磷酸鹽，同時生成有色或熒光物質(zhì)；來源：菌源性AP，腸粘膜AP。底物：β–半乳糖苷，鄰硝基酚β–半乳糖苷，乳糖（測葡萄糖含量）；來源：米曲霉。1.3酶和酶作用底物AP的底物β-Gal的底物對-硝基苯磷酸酯（pNPP）：經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）：酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。底物的選擇與使用1.容易獲取。2.性質(zhì)穩(wěn)定。3.對人的健康沒有危害或危害小。4.與相應(yīng)酶反應(yīng)后產(chǎn)生肉眼可見的明顯變化。5.與相應(yīng)酶反應(yīng)時間適中（固相酶免疫，10~30min；酶免疫組織化學(xué)，幾分鐘）。6.與相應(yīng)酶反應(yīng)條件不苛刻。底物應(yīng)具備的特點3酶和酶作用底物酶底物顯色反應(yīng)

測定波長（nm）

辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺

四甲基聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

2,2‘-胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

(ABTS)橘紅色

黃色

棕色

藍綠色492460449

642

堿性磷酸酯酶（AP）4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

(二)酶標記抗原或抗體酶標記抗原或抗體酶抗原/抗體通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

酶免疫技術(shù)的核心組成部分酶結(jié)合物（conjugate）酶標記物1.酶標記抗原或抗體條件抗原或抗體制備方法要求抗原要求純度高，抗原性完整?？贵w需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好。標記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性。酶標記物穩(wěn)定，不形成聚合物。2.酶標記抗原或抗體方法過碘酸鈉法（直接法）

原理：氧化酶分子含糖部分生成醛，醛基與IgG分子結(jié)合；特點：標記率高，條件不易控制，引起抗體活性下降常用制備方法

戊二醛交聯(lián)法原理：兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。特點：受酶分子上氨基數(shù)限制，產(chǎn)率低一步法二步法3.酶標記抗原或抗體純化及鑒定標記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度

常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純3.酶標記抗原或抗體純化及鑒定酶標記物的質(zhì)量鑒定1.生物活性測定：免疫電泳或雙向免疫擴散法，出現(xiàn)沉淀線2.酶標記抗體效價和工作濃度測定ELASA和棋盤滴定法3.酶標記率測定分光光度計測定結(jié)合物中酶和抗體蛋白的含量4.酶標記物保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。一、基本原理底物顯色定性或定量的分析包被將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234二、方法類型及反應(yīng)原理（一）檢測抗原的方法將己知抗體包被固相載體，待檢標本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.雙抗體夾心法（1）夾心法（sandwichELISA）Ab-Ag-AbES顯色（+）HBsAb/HBeAbhotdogHBsAg/HBeAgHBsAbE/HBeAbE查抗原

E固相抗體標本（含抗原）酶標抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原（1）將已知抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加待檢標本,溫育，洗滌。（3）加酶標抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。2．技術(shù)要點

E固相抗體標本（含抗原）酶標抗體EE底物（+）1、已知抗體包被載體3、加酶標抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物（無抗原）3、加酶標抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原2.雙位點一步法檢測抗原

即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對抗原分子上兩個不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標抗體。測定時將待檢標本和酶標抗體同時加入進行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進行顯色測定。

EEE底物固相抗體標本（含抗原）酶標抗體雙位點一步法檢測抗原在包被時使用一種單抗，酶標記時使用一種單抗3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌雙位點一步法測抗原

如果待檢標本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴重時，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將待檢標本適當(dāng)稀釋后重新測定。注意事項

EE底物固相抗體標本（抗原濃度高）酶標抗體E3.競爭法檢測抗原

酶標抗原和待檢抗原對固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競爭結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標抗原量與標本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標本中抗原含量呈反比。

酶標抗原

EEEE固相抗體標本（含抗原）底物E競爭法檢測抗原（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）待測管中加待檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，待檢標本中如果含有抗原，則與酶標抗原競爭固結(jié)合相抗體，使酶標抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對照管中只加酶標抗原，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。對照管中顏色深，待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。技術(shù)要點3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競爭法測抗原（二）檢測抗體的方法將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1.間接法

固相抗原標本（含抗體）酶標二抗底物EEE間接法檢測抗體酶標二抗是針對一類免疫球蛋白(如抗人IgG），因此該法只需要變換固相抗原，即可用一種酶標二抗測各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣的通用性4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體（+）YYY3.加酶標二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體（-）3.加酶標二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測抗體2.雙抗原夾心法

將已知抗原包被固相載體，待檢標本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。技術(shù)要點E固相抗體標本（含抗體）酶標抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體4.加酶作用的底物不顯色（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標抗原洗滌YEYYYYEYEYEYE