第八章 植物細胞培養(yǎng)

第七章

植物組織和細胞培養(yǎng)

2.細胞的發(fā)現(xiàn)

一般細胞都很小,要用顯微鏡才能看到。1665年,英國人Hooke用他改進的顯微鏡觀察軟木的結構,發(fā)現(xiàn)并命名了細胞。

3.細胞學說

德國植物學家Schleiden和動物學家Schwan于1838年提出細胞學說。

細胞學說內容：

A、植物和動物的組織由細胞構成;

B、所有的細胞由細胞分裂或融合而成;

C、卵和精子都是細胞;

D、一個細胞可分裂形成組織。

本世紀三十、四十年代,電子顯微鏡研制成功,放大倍數(shù)從光鏡的1200倍擴大到幾十萬倍。電子掃描顯微鏡

細胞的顯微及超微結構顯微結構（microstructure）指在光學顯微鏡下觀察到的結構。超微結構（ultrastructure）指在電子顯微鏡下觀察到的結構，也稱亞顯微結構。光鏡電鏡電鏡人們借助電子顯微鏡，在自然界中發(fā)現(xiàn)了比細胞更簡單的生命有機體——病毒。病毒是目前已知的最小的生命單位,它們只是由蛋白質外殼包圍核酸芯子所組成。

植物細胞的形狀與大小植物體由細胞構成（單細胞或多細胞）細胞的大小通常在20-50

m之間細胞的形態(tài)多樣，球形、多面體、立方體、長形等第一節(jié)植物細胞的形態(tài)與結構不同植物其細胞的大小不同，最小的細胞是支原體，直徑僅有0.1微米左右；西瓜瓤細胞直徑約1毫米；苧麻莖纖維細胞長可達550毫米。植物細胞的形狀也多種多樣，有長管狀、球狀等，植物細胞的形狀取決于其生理功能。

（二）植物細胞的基本結構

植物細胞雖然大小不同，形狀多樣，但是一般有相同的基本結構。

顯微結構(microscopicstructure)：由細胞壁和原生質體構成，后者又由質膜(plasmalemma)、細胞質（cytoplasm）和細胞核（nucleus）構成。

亞顯微結構(submicroscopicstructure)：在電子顯微鏡下顯示的細胞結構稱為亞顯微結構或超微結構。植物細胞的基本結構細胞壁

(cellwall)細胞原生質體(protoplast)細胞質(cytoplasm)和細胞核(nuclear)細胞器(organelle)質膜(plasmamembrane)

細胞結構全圖

電鏡下的細胞質體類型顏色功能葉綠體綠色光合作用有色體黃-紅色積累脂類和淀粉白色體無色合成淀粉，脂肪，蛋白質

細胞質內的細胞器種類很多。

(3)質體

質體是植物細胞特有的細胞器，幼期未分化成熟的，成為前質體。

分化成熟的質體可根據(jù)其顏色和功能不同，分為葉綠體（Chloroplast）、有色體（Chromoplast）和白色體（Leucoplast）三種主要類型。

在個體發(fā)育上，葉綠體來自前質體，由前質體發(fā)育成葉綠體。

B.有色體有色體含有類胡蘿卜素。類胡蘿卜素包括:葉黃素（黃色）、胡蘿卜素（紅色）。部分植物的花瓣、成熟的果實、胡蘿卜的貯藏根、衰老葉片都存在有色體。有色體的形狀有球形和不規(guī)則形狀。

C.白色體

白色體不含色素，存在于甘薯、馬鈴薯等植物的地下貯藏器官中。按照功能不同，可以分為：造粉體、造油體和造蛋白質體。在植物發(fā)育過程中，質體可以相互轉化。

光鏡下的淀粉粒（未染色）光鏡下的淀粉粒（染蘭色）油和脂肪植物細胞中，油和脂肪或多或少都存在，但通常是存在油料植物種子或果實中，由造油體合成。如花生、大豆、油菜的子葉，蓖麻的胚乳，都含有大量脂肪，可用蘇丹Ⅲ染色。

植物含油和脂肪模式圖，

人工蓖麻種子，含有脂肪的染色層第一節(jié)、植物細胞與細胞培養(yǎng)

原理概述：

1902年，德國植物學家Haberlandt提出：

細胞器官和組織可以不斷分割直至單個細胞，并嘗試分離植物并進行培養(yǎng)沒成功－－“植物組織培養(yǎng)之父”

19世紀30年代Schwan和Schleiden創(chuàng)立了細胞學說:

植物和動物都是由細胞構成的，細胞進行分裂而增多，并組建生物體。若具備的條件能同在活體內的一樣，每個細胞都用能獨立生存和發(fā)展。

1943年，美國的White提出植物細胞全能性的學說：每個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。（單個細胞經(jīng)人工培養(yǎng)，通過細胞分裂能恢復完整植株，并具有原植株的全部遺傳性。）植物培養(yǎng)中的幾個發(fā)現(xiàn)：

1934年，荷蘭植物學家溫特發(fā)現(xiàn)生長素－吲哚乙酸。后來相繼發(fā)現(xiàn)吲哚丁酸、奈乙酸、2,4－二氯苯氧乙酸（2,4-D酸）等。同時期發(fā)現(xiàn)B族維生素對植物細胞的重要性。

1953年，繆爾由無菌的冠癭組織的懸浮培養(yǎng)物及易碎的愈傷組織分離得到單個細胞，通過看護培養(yǎng)使細胞分裂生長－－開創(chuàng)了單細胞無性繁殖的工作。

1956年，米勒等在鯡魚精子DNA熱壓水解產物中，發(fā)現(xiàn)了有高度活力的促進細胞分裂和芽形成的物質，鑒定結構式，命名為激動素。促芽效果較腺嘌呤高許多，替代腺嘌呤。建立了激動素/生長素比例控制器官分化的激動模式。

1958年，施圖爾德等從胡蘿卜根韌皮部愈傷組織獲得單細胞，并經(jīng)誘導形成胚狀體再生植株－－這是世界上首次通過實驗證實了植物細胞具有全能性。

進入20世紀60年代后期，植物組織培養(yǎng)開始走向大規(guī)模的應用階段。

1960年莫雷爾采用蘭屬的莖尖培養(yǎng)，實現(xiàn)了去病毒和快速繁殖兩個目的。

按照根尖－－原球莖－－小植株的方式而再生。（按該方法，一年內1個半花莖很容易地繁殖出400萬株相同遺傳性的健康植物。）應用類似的方法，至今66屬以上的蘭科植物納入試管繁殖的體系。

1974年，格雷沙夫從葡萄花藥培養(yǎng)中，得到單倍體愈傷組織。

1975年、羅薩蒂從草莓花藥培養(yǎng)中，獲得小孢子發(fā)育的植株。

我國,20世紀30年代羅宗洛和李繼侗就已經(jīng)成為遠東植物培養(yǎng)的先驅者。

羅宗洛主要從事離體根尖的培養(yǎng)。

李繼侗發(fā)現(xiàn)了銀杏胚乳提取物對離體胚發(fā)育的促進作用。

20世紀80年代，我國研究重點明顯傾向于無性系的快速繁殖，并已進入不同的應用階段，如：草莓、甘蔗、波蘿、香蕉、各色觀賞植物等。目前，番茄、辣椒、馬鈴薯、生菜和花卉等也在應用。一、植物細胞全能性及分化（一）、植物細胞全能性：

是指植物細胞的每個活細胞都具有該植物全套遺傳信息，與合子一樣，具備發(fā)育成完整植株的潛能。

細胞全能性：

是細胞的某種特征，有這種能力的細胞保留形成有機體所有細胞類型的能力。

細胞全能性的實現(xiàn)：通過3個途經(jīng)－－A；B；C循環(huán)

A循環(huán)（生命周期）：以孢子體和配子體的世代交替實現(xiàn)細胞全能性。

B循環(huán)（細胞周期）：表示細胞的核質周期。通過核質的相互作用，DNA復制、mRNA轉錄和蛋白質合成，為細胞全能性形成和保持奠定基礎。

C循環(huán)（組織培養(yǎng)周期）：植物體器官、組織或細胞與供體失去聯(lián)系，無菌條件下，在人工合成的培養(yǎng)基中進行異養(yǎng)代謝，通過細胞脫分化、分裂、再分化過程實現(xiàn)細胞全能性。減數(shù)分裂受精作用細胞全能性種子幼年時期無性繁殖典型一致的無性系或品種成年時期花的形成翻譯轉錄復制DNA基因克隆愈傷組織全能性的實現(xiàn)分化游離細胞或原生質體原胚胚狀體人工種子試管小植株整體植株重建

生命周期（A循環(huán)）細胞周期（B循環(huán)）與供體失去聯(lián)系的分生組織（異養(yǎng)狀態(tài)）組織培養(yǎng)周期（C循環(huán)）細胞全能性的實現(xiàn)與利用胡蘿卜的愈傷組織菠蘿的愈傷組織

三者之間的關系：

生命周期（A循環(huán)）是通過細胞周期（B循環(huán)）來實現(xiàn)全能性的；

細胞周期中DNA的重組與克?。˙循環(huán)）也可通過組織培養(yǎng)周期（C循環(huán)）實現(xiàn)轉化和表達－B循環(huán)和C循環(huán)結合可繁殖有特殊遺傳性狀或目的基因的個體；

組織培養(yǎng)周期（C循環(huán)）又必須通過生命周期（A循環(huán)）來實現(xiàn)細胞全能性－－組織培養(yǎng)產生的個體再進入A循環(huán)。（二）、植物細胞分化細胞分化的本質是基因差別表達的結果。1、低等植物細胞分化現(xiàn)象：*藻類植物單細胞植物體無分化；*綠藻門的空球藻屬開始營養(yǎng)與繁殖作用的細胞分化；*褐藻門的海帶外形有片、柄、假根的分化，內部有表皮、皮層、髓細胞的分化。*細菌是單細胞生物，也有營養(yǎng)細胞和芽孢分化現(xiàn)象。*

真菌－－產生各類生理上有性別差異孢子的現(xiàn)象，是一種細胞分化現(xiàn)象。葫蘆蘚球溯蘚并齒蘚粗葉泥炭蘚金藻角藻藍綠藻赤灣異彎藻地衣地衣松蘿－地衣巖石苔蘚樹上苔蘚石松藻蘚－藻苔水生真菌的菌絲問荊幽門螺旋桿菌人工種子2、高等植物細胞分化現(xiàn)象高等植物分化較低等植物更復雜、更多樣化。*合子第一次分裂－－胚細胞（頂細胞）和柄細胞（基細胞）的分化；*胚細胞分裂、分化形成具根端和莖端的胚－－形成植物體不同功能的各個器官和組織。注：分化是進化的表現(xiàn)，分化水平越高細胞分工越細，機體代謝水平越高。（三）、離體條件下植物細胞的分化：

多種植物的不同部分細胞具有強烈的再生能力，離體培養(yǎng)時，條件適合，已分化的組織或細胞原有的分化狀態(tài)不再通過細胞分裂傳遞和保持下去，而發(fā)生脫分化現(xiàn)象。

愈傷組織：原意指植物因受創(chuàng)傷而在傷口附近產生的薄壁組織，現(xiàn)已泛指經(jīng)細胞與組織培養(yǎng)產生的可傳代的未分化細胞團。是一團無特定結構和功能的松散的薄壁細胞。這些細胞大小、形狀、液泡化程度、胞質含量、細胞壁特性等具有很大的差異。

細胞再分化

已脫分化的組織或細胞具較大的可塑性，在特定的離體條件下，重新恢復細胞分化能力，形成各種不同類型細胞的過程。

細胞脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化，或者叫做去分化。是指已分化的細胞失去其分化特征，恢復到分生組織狀態(tài)，即胚性細胞狀態(tài)。外植塊：當繼代培養(yǎng)時，將原培養(yǎng)物切割或不切割轉移至新的培養(yǎng)基中的材料，稱為～胚性細胞多細胞團形態(tài)建成完整植株分裂分化生長成熟細胞分生細胞多細胞團形態(tài)建成完整植株分化：脫分化：脫分化分裂再分化生長1、分化過程：三個時期－誘導期、分裂期和分化期。、誘導期(啟動期)：是細胞分裂的準備期

細胞結構變化：

核擴大并移至細胞中央，染色體和核仁改變，核糖體變密集，RNA迅速合成和積累，胞質變濃，大液泡解體，細胞恢復到具分裂能力的狀態(tài)－－成為胚性細胞。

時間：多為一天至數(shù)天。菊芋－－22h（未儲存）；－－44h(儲存后)胡蘿卜－－96h

、分裂期：細胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時期

整體變化：

外層細胞迅速分裂，細胞體積變小并回復到分生組織狀態(tài)，稱回復變化。細胞數(shù)目增加，體積最小。

細胞結構變化：細胞核和核仁最大，DNA含量最高，RNA含量持續(xù)上升、分化期：愈傷組織形成到器官發(fā)生時期

停止分裂的細胞發(fā)生生理代謝變化－愈傷組織－－細胞分化－－組織分化－－器官分化。

變化：a、各種酶活性增強RNA聚合酶活性－－RNA和組蛋白合成增強；淀粉酶活性——淀粉積累——根、芽分化提供能量。b、培養(yǎng)物中分化出擬分生組織和維管組織——導致器官原基的形成。

擬分生組織（分生組織結節(jié)）：

生長的愈傷組織中出現(xiàn)的類似分生組織的細胞群，其細胞體積小，壁薄，液泡小，細胞核和細胞質染色深?？梢杂梢粋€或幾個細胞形成。、植株再生的途徑兩種途徑：a、根芽器官直接分化形成植株－器官發(fā)生途徑?？梢韵乳L芽后長根（常見），或相反（少見）b、產生具胚芽、胚根的胚狀體結構再形成植株－體細胞胚胎發(fā)生。2、分化條件、影響脫分化的因素：a、生理或機械隔離：

脫離有機體，使細胞脫離了整體影響；機械隔離使外植體受到損傷，發(fā)生應激性反應，產生生化響應，發(fā)生呼吸活性、氣體交換率、代謝物含量等一系列變化，均對脫分化產生影響。b、培養(yǎng)細胞的異質性：

已分化的不同類型細胞之間存在很大的異質性，如生理狀態(tài)不同、染色體倍數(shù)性不同等。c、生長調節(jié)劑的影響：

生長素－2,4-D是啟動細胞分裂的重要因素。d、光線的影響:

光線對脫分化過程有一定影響。如：暗光切取的外植塊，進行暗培養(yǎng)有利于脫分化。外植塊脫分化愈傷組織再分化體細胞胚器官分化單極器官先莖后根具根莖的兩極器官先根后莖植株外植體脫分化與再分化形成完整植株的途徑：、影響維管形成組織分化的因素無論是植物活體還是離體條件下，細胞分化研究的重點是維管組織分化，特別是木質部分化。a、生長調節(jié)劑：

生長素對維管組織分化過程有顯著影響。*低濃度－－能刺激木質部發(fā)生，即，生長素濃度與木質部發(fā)生頻率之間存在負相關關系。*細胞分裂素－－主要對生長素起協(xié)調和增效作用。b、糖類物質：生長素對維管組織分化的作用，取決于糖的存在。蔗糖濃度與分化作用成正比。二、植物體細胞胚胎發(fā)生（一）、體細胞胚胎發(fā)生特點

表現(xiàn)在：

1、胚狀體是離體培養(yǎng)的產物

因此胚胎發(fā)生能力是培養(yǎng)的植物細胞具有的一個基本特征。

2、胚狀體起源于非合子細胞3、胚狀體發(fā)育過程與合子胚相似

同樣經(jīng)歷球形期、心型期、魚類期和子葉期階段。

鑒別胚狀體的標準1、胚狀體具雙極性

在方向相反的兩端分化出莖端和根端。2、在組織學上，胚狀體的維管組織與母體植物或外植體的維管組織通常沒有聯(lián)系，胚狀體維管組織呈獨立的“Y”字形。

誘導體細胞胚具有顯著特點1、具雙極性

體細胞胚發(fā)生早期就具有胚根和胚芽兩極，發(fā)育過程與合子胚相似，形成小植株?？梢詫l(fā)育至一定時期的體細胞胚制作成人工種子。2、生理隔離

體細胞胚與外植體的維管束系統(tǒng)聯(lián)系較少－－生理隔離。3、遺傳性相對穩(wěn)定體細胞胚形成再生植株較器官發(fā)生途徑形成植株變異性小。4、重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特征體細胞胚胎發(fā)生途徑是細胞全能性表達最完全的一種方式。（二）、體細胞胚胎發(fā)生途徑(5種)胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接的發(fā)生，分為五種。1、直接從器官外植體上發(fā)生經(jīng)表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體表面已分化細胞脫分化均可產生胚狀體。2、愈傷組織發(fā)生最常見的形式。表面、內部都可產生胚狀體。

胚性細胞團（EC）：愈傷組織中產生的體積小、液泡小、胞質濃的細胞團，稱～3、懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生形成胚狀體的數(shù)量大4、單倍體細胞發(fā)生指小孢子或大孢子細胞培養(yǎng)產生胚狀體。5、原生質體發(fā)生植物原生質體再生細胞壁經(jīng)分裂所產生的細胞團也可形成胚狀體。（三）、體細胞胚胎的起源體細胞胚胎起源于單細胞還是多細胞？

體細胞胚發(fā)生的實質是細胞分化－－細胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導部分基因開放，實現(xiàn)遺傳信息的表達。

絕大多數(shù)體細胞胚起源于單細胞。

單個胚性細胞具有明顯的極性，第一次分裂多為不均等分裂；頂細胞－－多細胞原胚基細胞－－胚柄

極性獲得的誘導因子是植物激素和外界刺激；極性建立對細胞分化和體細胞胚發(fā)生具有重要作用。（四）、體細胞胚胎的生殖隔離生理隔離是體細胞胚發(fā)生的先決條件※胚性細胞能否進一步分化和發(fā)育形成體細胞胚，、培養(yǎng)誘導條件的影響；

、細胞間的相互作用與競爭※只有能夠從周圍細胞獲得能量、物質、和信息的胚性細胞才能繼續(xù)分裂和分化，并能盡快和周圍細胞分開，脫離整體控制，相關基因得到表達，實現(xiàn)胚胎發(fā)生的全能性，完成胚胎發(fā)育的全過程。（五）、體細胞胚胎的遺傳穩(wěn)定性和變異性只有未畸變的細胞才能形成體細胞胚－－通過體細胞胚形成的植株是相對穩(wěn)定的?！泊嬖谧儺悾盒←溣着邽橥庵搀w－后代廣泛變異寧夏枸杞葉－染色體變異煙草、伊貝母、白蘭瓜等－染色體變異頻率與培養(yǎng)材料繼代次數(shù)呈正相關。※細胞分裂過程：DNA復制－染色體復制－細胞核復制－細胞復制和分裂。任何一步受阻或異常，都將導致染色體數(shù)目和結構的變異。三、影響植物細胞形態(tài)發(fā)生的因素影響因素有：

外因－－培養(yǎng)植物細胞的培養(yǎng)基和環(huán)境條件

內因－－植物細胞的遺傳性和生理狀態(tài)（一）、培養(yǎng)基及環(huán)境條件1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基中的生長調節(jié)類物質對離體條件下的植物細胞形態(tài)的發(fā)生具有很大影響。

根和芽的分化取決于生長素與細胞分裂素類的比值（控制器官分化的激素模式）；有時器官分化也取決于其絕對濃度。外植體脫分化形成愈傷組織再分化分化成芽分化成根完整植株低細胞動素/生長素高細胞動素/生長素高生長激素（2,4-D）激素控制器官分化的模式圖、培養(yǎng)基中的生長類激素生長素作用分兩個階段a、生長素（主要是2,4-D）對愈傷組織的誘導及胚胎發(fā)生叢的形成是必不可少的。－－愈傷組織增殖，但不能發(fā)育成熟（我們稱含有生長素培養(yǎng)基為體細胞胚胎發(fā)生的“誘導培養(yǎng)基”）b、降低2,4-D濃度，相對提高細胞分裂素與生長素的濃度－－分生區(qū)細胞分裂，形成胚胎發(fā)育條件。

（第二階段要將培養(yǎng)物移至無生長素或的濃度生長素的培養(yǎng)基中）、培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分

培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分對器官分化和胚狀體發(fā)生具有很大影響。*生根培養(yǎng)基－無機離子濃度小，如：減半的MS培養(yǎng)基。*促進器官分化－提高培養(yǎng)基中無機磷含量；提高AA、嘌呤、嘧啶類物質。*其他：糖的濃度可以影響器官分化和胚狀體的發(fā)生發(fā)育；氮源對胚胎發(fā)生有重大影響。、培養(yǎng)基的物理性質

滲透壓、pH、固態(tài)或液態(tài)等都對細胞形態(tài)發(fā)生有影響。*糖對滲透壓起決定作用，其次是甘露醇、鹽類。*pH范圍：5.6－6.0*固、液態(tài)要視不同培養(yǎng)物的情況而定。如：胡蘿卜在固體培養(yǎng)基上誘導愈傷組織；在液態(tài)培養(yǎng)基上增殖和產生胚狀體。2、環(huán)境條件光照和溫度對器官發(fā)生和胚狀體形成有較大的影響。*光對細胞形態(tài)發(fā)生的作用是一種誘導反應包括光強、光周期和光質。通常1000—1500lx*光質：

紅光－有利于生根紫外光和藍光－－有利于芽發(fā)生*溫度：一般采用25℃（二）、培養(yǎng)材料生理條件1、器官組織類型

不同種植物的器官組織產生的愈傷組織器官分化明顯不同。（由材料的基因型決定）。如：煙草、胡蘿卜等易誘導器官形成；棉花、豆類則較難。2、個體發(fā)育年齡

外植體幼嫩比較容易誘導形成愈傷組織。3、愈傷組織生理狀態(tài)

愈傷組織繼代次數(shù)越多，器官分化能力越低。

第二節(jié)、植物離體無性繁殖

離體無性繁殖是植物是目前植物組織培養(yǎng)技術應用于生產最多、最廣泛和最有效的實例。

利用鱗莖、球莖、塊根等營養(yǎng)器官繁殖的植物，可以保持原植物品種優(yōu)良特征，繁殖率極高。具有巨大的經(jīng)濟價值。一、植物離體無性繁殖的概念和意義（一）、植物離體無性繁殖的概念

植物離體繁殖：（簡稱離體繁殖、微型繁殖或快速無性繁殖）利用組織培養(yǎng)方法進行植物離體培養(yǎng)，在短期內獲得大量遺傳性一致個體的方法。

試管苗：離體無性繁殖獲得的植株稱~。（二）、植物離體無性繁殖的意義1、繁殖速度快，經(jīng)濟效益高一個外植體一年可以繁殖數(shù)以萬計的苗木。2、占用空間小，不受季節(jié)限制，便于工廠化育苗一間30m2的培養(yǎng)室，可以同時存放1萬多個瓶子。3、繁殖各種珍稀、瀕危苗木和突變體，為育種服務。二、植物離體無性繁殖中的器官

發(fā)生方式植物離體無性繁殖中器官發(fā)生方式有5種（一）、不定芽型

指選取具有頂芽和腋芽的短枝無菌培養(yǎng)，誘導芽萌發(fā)成苗（枝條）或增殖產生許多不定芽發(fā)育成苗，最后再生根形成植株。

特點：、繁殖率高。、能保持該種植物的遺傳穩(wěn)定性。、可使繁殖周期長的林木縮短其童年期。

（二）、器官型

指直接從莖、葉、鱗片等外植體上誘導不定芽或帶芽的休眠器官（如小鱗莖、小球莖、小塊莖）產生，再生成植株的方式。

特點：、繁殖率非常高但繁殖速度較慢、遺傳性穩(wěn)定（三）、器官發(fā)生型指誘導器官外植體產生愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)形成芽、根或胚狀體再生成植株的方式。

特點：、繁殖速度較快、培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織階段再生成植株，遺傳性不穩(wěn)定，易產生變異。、愈傷組織是遺傳轉化、細胞培養(yǎng)或原生質體培養(yǎng)的良好材料。（四）、胚狀體發(fā)生型指植物器官、組織和細胞外植體經(jīng)培養(yǎng)脫分化形成胚狀體再成苗的方式。特點：、胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、結構完整、繁殖系數(shù)高、遺傳性穩(wěn)定。（五）、原球莖型是蘭屬特有的器官發(fā)生方式，即外植體經(jīng)培養(yǎng)產生原球莖，再直接長成植株。一個蘭花莖尖經(jīng)一年反復誘導培養(yǎng)可產生400萬株蘭花苗。三、植物離體無性繁殖方法和

影響因素（一）、植物離體無性繁殖方法1、母株制備母株－用于發(fā)生離體培養(yǎng)無性系的植物材料。

技術關鍵：、材料滅菌－－根據(jù)不同材料采用不同的消毒方式。、培養(yǎng)基篩選－－離體培養(yǎng)成功的關鍵2、增殖指繁殖體的增殖階段。是快速繁殖過程最主要的階段。

關鍵：、選擇一條最適合該外植體的途徑。、適合培養(yǎng)基的選擇、適宜的激素種類及濃度配比注：芽增殖時，外源激素的積累可導致畸形芽的產生－－調整激素濃度。3、植株再生及鑒定將繼代增殖的小芽（苗），轉移至生根培養(yǎng)基中，誘導根分化，最終形成具根、莖、葉的完整小植株的過程，稱植株再生。

關鍵：、培養(yǎng)基是根分化的技術關鍵。、高水平的生長素（極少用2,4-D），低水平細胞分裂素或僅有生長素即可。、難生根－－生長素加黑暗。

鑒定－細胞學和形態(tài)學等方法檢查再生植株是否有遺傳變異。4、煉苗和移植

讓試管苗適應自然環(huán)境的過程，稱煉苗。煉苗馴化過程要逐步過渡。

移栽、將小苗基部培養(yǎng)基沖洗干凈－避免有害微生物侵害。、移植小苗的基質同上述生根培養(yǎng)基質，應用前消毒。、注意保濕，空氣濕度為70％－90％。（二）、植物離體無性繁殖的影響因素外植體誘導、增殖、分化過程產生完整植株是一復雜過程受眾多因素影響。1、培養(yǎng)基選擇適宜的培養(yǎng)基、激素以及其他添加物。如：大多數(shù)植物－－MS培養(yǎng)基LS、SH等也可。

激素：

細胞分裂素1－2mg/L；6-BA為首選。生長素0.1－1mg/L；NAA、IBA。誘導愈傷組織或體細胞胚胎發(fā)生選用2,4-D。2、培養(yǎng)條件

離體無性繁殖與溫度、光照、濕度等密切相關。*溫度：25＋2℃，一般不低于15℃，不高于35℃*光照：1000～1500lx每天16h光照，8h黑暗*濕度：培養(yǎng)器內的濕度為100％；一般保持在70％～90％3、外植塊外植體取材幾乎包括植株的各個部位，不同種類植物及同種植物不同外植體誘導率又很大差別。因此，應綜合考慮。如：材料來源、組織、器官類型、外植體大小、生理年齡等因素。第三節(jié)、無病毒植物培養(yǎng)20世紀50年代初，Morel發(fā)現(xiàn)用根尖培養(yǎng)方法，從嚴重感染病毒的大麗花植株得到無病毒苗。一、病毒在植物體內的分布及危害（一）、病毒在植物體內的分布葉片（達到一定濃度）－－韌皮部－－隨維管束大范圍轉移到植株其他部位。

*老葉和成熟組織及器官中病毒含量高；

*幼嫩和未成熟的組織和器官中病毒含量低。（二）、病毒對植物的危害無性繁殖的植物，都易受到一種或多種病毒的侵害。

感染途徑：營養(yǎng)體、刀具、土壤等傳遞給后代。

種類：植物病毒超過500種。注：病毒危害與真菌和細菌不同，不能通過化學殺菌劑和抗生素進行防治和消除。因而只能用脫毒的方法。（三）、植株脫病毒的意義1、植物組織培養(yǎng)脫毒技術是植物細胞工程的重要組成部分2、脫毒種苗的生產可以提高作物質量和產量。3、脫毒育苗可以防止品種退化問題。4、可以減少農藥的施用，防止病害的蔓延與擴散。二、植物脫病毒方法主要有物理方法、化學方法和生物學方法。（一）、物理方法：1、高溫處理（溫熱療法）：

原理：V受熱后不穩(wěn)定，活性鈍化，繁殖能力降低，失去侵染能力；而植物細胞分裂加速，不受高溫傷害。

方法：溫湯浸漬處理和熱風處理、溫湯浸漬處理：

適于切下的休眠組織材料。方法：

50℃左右的溫水中浸漬材料數(shù)分鐘至數(shù)小時（達55℃，大多數(shù)植物材料被殺死。）熱風處理：適于生長組織方法：

將生長的盆栽植物材料在35℃～40℃的生長箱或室內處理數(shù)十分鐘或長達數(shù)月；切取處理后新長出的枝條作接穗。2、低溫處理（冷療法）如：

菊花矮化病毒（CSV）和菊花褪綠斑駁病毒（CCMN）的植株，經(jīng)5℃處理4個月，獲得67％的去CSV無病毒苗、22％去CCMN無病毒苗。（二）、化學方法

利用化學藥品處理：

嘌呤和嘧啶類似物、AA、抗生素等抑制植物體內病毒復制。

常用：孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤（三）、生物方法利用植物根尖、珠心胚、愈傷組織等外植體進行培養(yǎng)取出病毒。1、莖尖培養(yǎng)最有效的脫毒方法。注：切取莖尖的大小與脫毒效果有直接的關系－莖尖越小，去病毒機會越大。

莖尖通常取材0.2~0.5mm。

原則：既要保證脫毒效果，又要提高外植體成活率。2、微體嫁接法

木本植物不能采用莖尖培養(yǎng)

方法：

將極小的莖尖（0.14~1.0mm）作為接穗嫁接到不帶病毒的種子實生苗砧木上將砧木、接穗一起在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

應用：

蘋果、柑橘、桃等木本植物3、珠心組織培養(yǎng)法柑橘類植物除合子胚外，還有多個珠心胚。珠心組織與維管束系統(tǒng)沒有直接聯(lián)系，故珠心組織培養(yǎng)可獲得無病毒植株。

該方法的缺點：

、有20％～30％左右的變異率。、無病苗的苗期較長。4、愈傷組織脫毒各種器官和組織經(jīng)誘導都可產生愈傷組織，在分化培養(yǎng)產生芽，長成植株。

原理：、V在植物體內分布不均，由無V的細胞產生的愈傷組織是獲得無V苗的基礎。、愈傷組織細胞V濃度較低，在愈傷組織細胞快速分裂的過程中，V的復制能力衰退或丟失。、繼代培養(yǎng)的愈傷組織中容易產生抗性變異細胞，在人工誘導下，變異更顯著，產生不帶V的愈傷組織。三、脫毒植物檢測及保存（一）、檢測方法1、直接測定法：

直接觀察植株莖、葉等器官有無病害引起的可見癥狀。

缺點：

不夠直接，靈敏。2、指示植物法

原理：利用指示植物對V的敏感性。

發(fā)現(xiàn)：1929年美國病毒學家Holmes發(fā)現(xiàn)，用已被TMV感染的普通煙葉粗汁液與金剛砂相混，在心葉煙葉子上摩擦，2～3d后，后者葉片上出現(xiàn)局部壞死斑，且在一定范圍內，枯斑數(shù)與侵染V濃度成正比。

指示植物（2種）：、在接種V后產生的癥狀可擴展到非接種部位、只在接種部位產生明顯的病斑。

方法：、摩擦接種法：處理待檢查的植株葉片的汁液與金剛砂混合－－輕輕摩擦指示植物葉片，使汁液侵入葉片表皮細胞但不損傷葉片－－用水沖洗葉片－－觀察。、嫁接法：適用于不能通過汁液傳播的。用被鑒定植株芽作接穗，指示植物作砧木－－觀察指示植物。3、抗血清鑒定方法用已知病毒的的抗血清來鑒定未知V的種類。

特點：

簡便、準確、速度快，（一般幾分鐘至幾小時即可完成）。準確率高。

方法：

試管沉淀、凝集試驗、免疫擴散、免疫電泳、熒光抗體技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗等多種方法。V感染人工注射異體蛋白動物動物血清反應帶該種v植物（抗原）（抗體）（抗原）血清鑒定法示意圖4、電鏡檢查法采用電子顯微鏡直接觀察樣品材料有無V感染。

特點：既準確又有效。

技術要求高：

超薄切片技術、背景染色技術、掃描電鏡等5、分子檢測法

利用已知V的核苷酸序列或同組V的相似序列區(qū)域來設計引物，將待測樣品用PCR技術體外擴增DNA、隨機擴增的產物進行分子生物學方面的分析，從而鑒定是否有病毒感染。

特點：快速、簡便、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點。（二）、無病毒原種的保存與繁殖1、無病毒原種的保存

主要是利用隔離法進行保存。

注意事項：、隔離區(qū)，最好將原種材料種植保存在網(wǎng)室中，防止昆蟲特別是傳染V的蚜蟲侵入。、種植區(qū)土壤也應消毒、防止工具、衣服等接觸傳染V。、定期復查。2、無病毒原種的繁殖*

關鍵是防止V再度感染。*建立一整套嚴格的良種繁殖制度，生產上做好土壤的消毒和防昆蟲工作；保持無V原材料質量。*一旦感染，及時替換感病植株。第四節(jié)、植物細胞培養(yǎng)

意義：、植物細胞培養(yǎng)有助于研究植物細胞的特性和潛力。、了解細胞間的相互關系、研究細胞分化、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的分子機理。、細胞代謝研究，各種不同物質對細胞的影響研究。一、單細胞分離方法（3種）（一）、機械法：

是從完整的植物器官中分離單細胞的方法之一。

優(yōu)點：、細胞未受酶傷害、有利于進行細胞的生理生化研究。*方法一：研磨法*方法二：搖床振蕩方法，使懸浮培養(yǎng)中疏松易碎的愈傷組織細胞分散成單細胞和小細胞。(二)、酶法利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他組織，使細胞分離的方法。

注意：酶對細胞壁有一定的軟化的不良作用，因此，必須加入甘露醇等滲透壓保護。

優(yōu)點：可以得到較多的葉肉游離細胞。但對禾本科植物葉片較困難。（三）、化學法利用一些化學藥劑游離細胞的方法。常用：草酸鈣－胡蘿卜；秋水仙素、2,4－D或LH，對分散細胞均有一定作用。二、單細胞培養(yǎng)方法和影響因素（一）、培養(yǎng)方法可以分為懸浮培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、微室培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng)

將植物