食品微生物學實驗：微生物細胞大小的測定和顯微鏡直接計數(shù)

專業(yè)：食品科學與工程姓名：專業(yè)：食品科學與工程姓名：__陳建楊_______學號：__3061321040___日期：________________地點：________________課程名稱：食品微生物學實驗指導老師：_尹源明________成績：__________________實驗名稱：微生物細胞大小的測定和顯微鏡直接計數(shù)實驗類型：________________同組學生姓名：__________一、實驗目的和要求（必填） 二、實驗內(nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設備（必填） 四、操作方法和實驗步驟五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理 六、實驗結(jié)果與分析（必填）七、討論、心得一、實驗目的和要求1、學習接目測微計的校正方法，了解血球計數(shù)板的構造和計數(shù)原理。2、學習使用顯微鏡測微尺測定微生物細胞大小，掌握用血球計數(shù)板測定微生物細胞總數(shù)的方法。二、實驗內(nèi)容和原理裝訂線1、顯微測微尺由鏡臺測微尺和目鏡測微尺兩部分組成。后者可直接用于測量細胞大小。它是一塊圓形玻片，其中央有精確等分到度，測量時將其放在接目鏡中的隔板上。由于目鏡測微計所測量的是微生物細胞經(jīng)過顯微鏡放大之后所成像的大小，刻度實際代表的長度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數(shù)及鏡筒的長度而改變，所以，使用前須先用鏡臺測微計進行標定，求出某一放大率下，目鏡測微計每一小格所代表的長度，然后用目鏡測微計直接測被測對象的大小。鏡臺測微計是一塊中央有精確刻玻片，刻度的總長為lmm，等分為100小格，每小格長10um，專用于對目鏡測微計進行標定的。裝訂線2、利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。三、主要儀器設備1、器械：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺，載玻片、蓋玻片、血球計算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤、洗瓶、接種環(huán)、酒精燈、火柴、滴管2、材料：培養(yǎng)好的啤酒酵母斜面菌體和菌懸液、染液四、操作方法和實驗步驟1、微生物菌體大小的測定①目鏡測微尺的校正：更換目鏡鏡頭：更換目鏡測微尺鏡頭（標記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，制成一個目鏡測微尺的鏡頭。某一倍率下標定目鏡刻度：將鏡臺測微尺置于載物臺上，使刻度面朝上，先用低倍鏡對準焦距、看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器使兩尺重疊，并使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度間的目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。計算該倍率下目鏡刻度：目鏡測微尺每格長度=鏡臺測微尺格數(shù)/目鏡測微尺格數(shù)xl0um標定并計算其他放大倍率下的目鏡刻度：以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測定目鏡測微尺每格代表的實際長度。如此測定后的測微尺的長度，僅適用于測定時使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。②菌體大小的測定將啤酒酵母制成水浸片。P.實驗名稱：_______________________________姓名：________________學號：__________________P.大小換算：將標本先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺測定每個菌體長度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長和寬。求平均值：一般測量微生物細胞的大小，用同一放大倍數(shù)在同一標本上任意測定l0一20個菌體后，求出其平均值即可代表該菌的大小。2、用血球計數(shù)板測定微生物細胞的數(shù)量①檢查血球計數(shù)板取血球計數(shù)板一塊，先用顯微鏡檢查計數(shù)板的計數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著的菌體，若有污物則通過擦洗、沖洗，使其清潔。鏡檢清洗后的計數(shù)板，直至計數(shù)室無污物時才可使用。②

稀釋樣品將培養(yǎng)后的酵母培養(yǎng)液振蕩振搖混勻，然后作一定倍數(shù)的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含4～5個菌體的稀釋度為宜。③加樣取出一塊干凈蓋玻片蓋在計數(shù)板中央。用滴管取1滴菌稀釋懸液注入蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置5—10分鐘。④鏡檢裝訂線待細胞不動后進行鏡檢計數(shù)。先用低倍鏡找到計數(shù)室方格后，再用高倍鏡測數(shù)。一般應取上下及中央五個中格的總菌數(shù)。計數(shù)時若遇到位于線上的菌體，一般只計數(shù)格上方（下方）及右方（左方）線上的菌體。每個樣品重復3次。裝訂線⑤計算取以上計數(shù)的平均值，按下列公式計算出每毫升菌液中的含菌量。

菌體細胞數(shù)＝小格內(nèi)平均菌體細胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)⑥清洗計數(shù)板用畢后先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若計數(shù)的樣品是病原微生物，則須先浸泡在5%石炭酸溶被中進行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理微生物菌體大小的測定目鏡測微尺的校正目鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺格數(shù)1010201910402075菌體大小的測定細菌序號12345678910長/格22.522.53.13.02.22.41.93.2寬/格0.20.20.20.30.20.30.50.30.20.42、用血球計數(shù)板測定微生物細胞的數(shù)量小方格數(shù)44444平均值/個/格細菌數(shù)目32292830287.35六、實驗結(jié)果與分析P.實驗名稱：_______________________________姓名：________________學號：__________________P.1、計算出目鏡測微尺在低、高倍鏡下的刻度值利用公式：目鏡測微尺每格長度=鏡臺測微尺格數(shù)/目鏡測微尺格數(shù)xl0um，可得低倍鏡下（10*10放大倍數(shù)）目鏡測微尺的刻度值=20/19*10um=10.526um高倍鏡下（10*40放大倍數(shù)）目鏡測微尺的刻度值=20/75*10um=2.667um記錄菌體大小的測定結(jié)果記錄菌體大小的測定結(jié)果由高倍鏡下目鏡測微尺的刻度值可得油鏡下的目鏡測微尺刻度值：2.667*40/100=1.067um細菌序號12345678910平均值長/nm3.1342.6683.1342.6683.3083．2012．3472.5612.0273.4142.846寬/um0.2130.2130.2130.3200.2130.3200.5340.3200.2130.4270.2993、計算樣品中酵母菌濃度裝訂線利用公式：菌體細胞數(shù)＝小格內(nèi)平均菌體細胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)，可得：裝訂線菌體細胞數(shù)=7.35*400*104*1=2.94*107于是菌體濃度=菌體細胞數(shù)/V=2.94*107個/1mL=2.94*107個/mL分析油鏡下目鏡測微尺的刻度值用高倍鏡（10*40）的結(jié)果推得，原因是油鏡下若要側(cè)目鏡測微尺的刻度值，則必須在物鏡測微尺上滴香柏油，這樣會損壞物鏡測微尺。而且從低倍鏡和高倍鏡下目鏡測微尺的刻度值可以看出，由低倍鏡推得高倍鏡的刻度值為10.526*400/100=2.632，與實際測得的值之間的誤差為△=(2.667-2.632)/2.667*100%=1.31%。因此油鏡條件下由400倍的目鏡測微尺的刻度值推得1000倍放大倍數(shù)下的目鏡測微尺的刻度值是合理的。在實驗中得知，所得的菌體濃度偏低，幾和其他組已經(jīng)稀釋過的菌體濃度相似。原因可能是我們所測得菌體濃度是其他組已經(jīng)稀釋過的菌體（很多組同用一支細菌懸濁液）。七、討論、心得1、為什么目鏡測微尺必須用鏡臺測微尺來校正？由于目鏡測微計所測量的是微生物細胞經(jīng)過顯微鏡放大之后所成像的大