段旭昌免疫磁珠分離技術(shù)(IMB)及在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用

免疫磁珠分離技術(shù)（IMB）

及在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用

段旭昌副教授西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2013910提綱磁性微球磁性微球結(jié)構(gòu)、分類及特點(diǎn)磁性微球的制備磁性微球分離技術(shù)免疫磁株免疫磁珠結(jié)構(gòu)與性質(zhì)免疫磁株的特點(diǎn)免疫磁珠的分類免疫磁珠的制備免疫磁珠分離技術(shù)免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展望一磁性微球是通過(guò)一定方法將磁性無(wú)機(jī)粒子與有機(jī)高分子結(jié)合形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的體積在幾納米到幾十微米之間的復(fù)合微球。高分子磁性微球表面具有眾多表面功能基團(tuán)，同時(shí)具有磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向功能。目前已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分離工程等領(lǐng)域。二磁性微球結(jié)構(gòu)、分類及特點(diǎn)磁性核材料多為Fe、Co、Pt、Ni等金屬及其氧化物。如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、鐵鈷合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4應(yīng)用最多。構(gòu)成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物質(zhì)。天然高分子有明膠、球蛋白、牛血清白蛋白、聚賴氨酸、淀粉和多種聚糖如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖、果膠等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。這些材料可單獨(dú)用，也可復(fù)合使用。磁性微球表面可根據(jù)需要賦予不同的功能基團(tuán)(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—環(huán)氧基、—CHCl等)，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同物理性質(zhì)。同時(shí)具有磁響應(yīng)性，在外磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向性。導(dǎo)電聚合磁微球聚合磁微球?qū)Υ判晕⑶虻囊螅毫骄鶆?、大小合適、比表面積大、吸附力強(qiáng)、具有強(qiáng)的超順磁性、懸浮均勻穩(wěn)定性好、不易聚集沉淀、表面具有多種活性基團(tuán)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、具有較好生物相容性、對(duì)細(xì)胞、機(jī)體、活性物質(zhì)損傷小。由于環(huán)氧基、氯甲基功能基團(tuán)非?；钴S，不需連接其他活性基團(tuán)即可與生物配基（如抗體、抗原等）偶聯(lián)，及其他基團(tuán)的微型磁珠在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用較為廣泛。三磁性微球的制備

磁性微球制備方法：共沉淀法、懸浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法等。1.共沉淀法

金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應(yīng)生成磁性高分子微球的方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先通過(guò)單體聚合反應(yīng)得到PS-AAEM顆粒分散劑，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）顆粒的分散劑中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉積，制得PS-AAEM為核心、Fe3O4粒子為殼層的磁性微球。微球的磁性能通過(guò)改變FeCl2和FeCl3的濃度或改變PS-AAEM核心的尺寸來(lái)控制。Xia等把一定配比的FeCl2、FeCl3與葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超聲連續(xù)作用下水浴加熱，制得以Fe3O4為核、dextran為殼的磁性微球。楊玉東等把一定配比的FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O與配體（如二亞乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）組成的混合液體加入到75℃的葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制備了葡聚糖為殼、氧化鐵為核的磁性微球。2聚合法制備磁性微球過(guò)程異相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、懸浮液聚合三種。該法是將磁性粒子用表面改性劑、偶聯(lián)劑、引發(fā)劑等處理后分散到含有聚合物單體的溶劑中進(jìn)行聚合反應(yīng)。通常以磁性粒子為活性中心進(jìn)行單體聚合。四磁性微球分離技術(shù)MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是將免疫學(xué)+細(xì)胞生物學(xué)+磁力學(xué)結(jié)合為一體，利用磁性微球表面功能基團(tuán)的專一親和特性或多孔吸附特性吸附特定組分，然后用外力磁場(chǎng)作用將吸附了特定物質(zhì)的磁珠加以分離，再經(jīng)過(guò)洗脫磁珠上吸附的目標(biāo)物質(zhì)的一種新型分離技術(shù)，具有廣泛的用途。

幾種DNA

分離方法的比較ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

傳統(tǒng)法鰲合樹脂法玻璃粉法磁珠法免疫親和法DNA提取酚/氯仿等溶劑抽提Chelex100樹脂吸附玻璃粉吸附離心分離磁珠吸附磁場(chǎng)分離抗原抗體反應(yīng)磁場(chǎng)分離適用范圍大多數(shù)標(biāo)本DNA提取純化培養(yǎng)及各種臨床標(biāo)本土壤標(biāo)本冰凍、陳舊組織冰凍、陳舊組織，樣本含量很少的標(biāo)本方法評(píng)價(jià)DNA純度高、含量多，但較費(fèi)時(shí)，步驟繁瑣，用有機(jī)溶劑，有損操作者健康?？捎糜谂囵B(yǎng)標(biāo)本和各種臨床標(biāo)本細(xì)菌及部分病毒核酸的提取。方法簡(jiǎn)便，可用于土壤中細(xì)菌芽孢DNA的提取，不能徹底除去PCR抑制劑。簡(jiǎn)單、快速，整個(gè)過(guò)程不到2h，可獲得較純DNA。適于少量樣本。DNA純度高，含量多，適于樣本含量少標(biāo)本，單克隆抗體的制備是關(guān)鍵。五免疫磁珠免疫磁珠（IMB）也稱免疫磁性微球，是在磁性微球表面偶聯(lián)上免疫配基的一種磁性微球，是將磁性微球技術(shù)和免疫學(xué)相結(jié)合的特殊磁性微球。六免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)免疫磁珠核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子材料，最外層是免疫配基。免疫配基

免疫配基通過(guò)生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同，從而可結(jié)合不同的免疫配基，如抗原、抗體、凝集素、DNA和RNA等。配基必須具有生物專一性的特點(diǎn)，而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性，保證磁珠的特殊識(shí)別功能。免疫磁珠的性質(zhì)具有均勻性、超順磁性及保護(hù)性外殼，由磁性載體微球和免疫配基結(jié)合而成，表面具有專一親和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形狀具有均一性，可使靶物質(zhì)迅速有效地結(jié)合到磁珠上，可使新生成復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有相同磁響應(yīng)性，且行為一致。磁珠球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子間的非特異性結(jié)合，順磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)，從磁場(chǎng)移出時(shí)磁性消除，磁珠分散，可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向。保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕；免疫配基可專一性結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)。七免疫磁株的特點(diǎn)磁性微球與免疫配基結(jié)合牢固。不影響或改變免疫配基原有的生物特性和特異性。免疫微球的識(shí)別專一性。在磁場(chǎng)中具有順磁性，離開(kāi)磁場(chǎng)磁性消失，易于分散。

由于聚苯乙烯磁性微球強(qiáng)度高、表面易進(jìn)行化學(xué)維修飾，是比較理性的制造免疫磁珠的材料。八免疫磁珠的分類

根據(jù)磁珠在磁場(chǎng)中受力大小及磁珠體積，分為小磁珠和大磁珠。大磁珠：1-5um，粒徑較大、懸浮穩(wěn)定性差、易沉淀、比表面積小、吸附能力低、吸附活性配基少、對(duì)細(xì)胞影響大，特別是陽(yáng)性分選時(shí)需將磁珠與細(xì)胞解離后方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。但磁力強(qiáng)，無(wú)需特殊分離柱即可實(shí)現(xiàn)樣品分離，分離速度快、過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低。小磁珠：50nm以下，粒徑較小、懸浮穩(wěn)定、比表面積大、表面吸附活性配基多，只有細(xì)胞體積的萬(wàn)分之一，對(duì)細(xì)胞表型和功能影響小，不影響細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)。但磁力弱，需特殊分離柱才能實(shí)現(xiàn)樣品分離，分離速度慢，成本高九免疫磁珠的制備免疫磁珠的制備是將磁性微球和抗體等配基結(jié)合而成。磁性微球與抗體的連接方式有共價(jià)結(jié)合和吸附結(jié)合兩種方式。共價(jià)結(jié)合：依靠磁珠表面的活性基團(tuán)如-CHO、-COOH等與抗體Fab段上的-NH2共價(jià)反應(yīng)和結(jié)合吸附結(jié)合：依靠磁珠巨大的比表面與抗體見(jiàn)得非特異性吸附而結(jié)合。共價(jià)結(jié)合的牢固度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸附結(jié)合牢固度。制備方法：先制備磁性微球，然后將磁性微球分散于抗體配機(jī)溶液中使磁珠與抗體充分吸附結(jié)合，然后分離免疫磁珠分散于緩沖溶液中可以使用。十免疫磁珠分離技術(shù)免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)分離技術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)磁性微球檢測(cè)和分離技術(shù)。它是以抗體包被的微球磁珠為載體，通過(guò)抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原—抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)作用下發(fā)生定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的。

基本原理：磁性微球經(jīng)過(guò)一定處理后,將抗體結(jié)合到磁珠上,形成免疫磁性微球（標(biāo)記磁珠）,標(biāo)記磁珠的抗體與特異性抗原結(jié)合形成抗原—微球復(fù)合物,該復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有與其它組分不同的磁響應(yīng)性,在磁力作用下,該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動(dòng),從而達(dá)到分離抗原的目的。以細(xì)胞分離為例圖解免疫磁珠技術(shù)的原理免疫磁珠標(biāo)記方法1直接磁珠和直接標(biāo)記法通過(guò)物理吸附和共價(jià)鍵結(jié)合直接將特意性抗體與磁珠耦合，然后再與相應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，形成細(xì)胞-抗原-抗體-磁珠復(fù)合物，在外磁場(chǎng)下直接分離目的細(xì)胞。快速、簡(jiǎn)單、特異性和細(xì)胞得率高，靈敏度低，需制備相應(yīng)的偶聯(lián)抗體磁珠。2簡(jiǎn)介磁珠和間接標(biāo)記法使用anti-lg等與磁珠偶聯(lián)，通過(guò)Anti-lg再使磁珠與二抗體偶聯(lián)，分離細(xì)胞時(shí)，先使細(xì)胞與一抗特異性結(jié)合，然后在與一抗標(biāo)記磁珠結(jié)合，形成細(xì)胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠復(fù)合體，在外磁場(chǎng)下分離目的細(xì)胞的方法。該法增加了細(xì)胞的洗滌步驟，特異性也會(huì)降低。該法一般用于①?zèng)]有直標(biāo)磁珠抗體②需用幾種抗體去除多種細(xì)胞③目的細(xì)胞上特異性抗原分子表達(dá)水平低。MACS微珠直標(biāo)微珠多選微珠間標(biāo)微珠免疫磁珠分選方法陽(yáng)性分選：運(yùn)用特異性抗體偶聯(lián)磁珠直接從細(xì)胞混合物中分離目的細(xì)胞的分選方法稱為positiveselection.陽(yáng)性分選中磁珠標(biāo)記的細(xì)胞即為目的細(xì)胞。該法簡(jiǎn)單、快速、細(xì)胞得率和純度較高。如采用anti-CD14磁珠分選CD14+巨噬細(xì)胞。陰性分選：用抗體偶聯(lián)磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使目的細(xì)胞得以純化和分離的分選方法稱為negativeselection.陰性分選中磁珠標(biāo)記的細(xì)胞為非目的細(xì)胞。如分離CD4+T細(xì)胞時(shí)，由于沒(méi)有專用的CD4+T細(xì)胞分選磁珠，可通過(guò)anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119標(biāo)記磁珠去除CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等，最終而獲得較純的CD4+T細(xì)胞。因此陰性分選法適用于：①?gòu)募?xì)胞混合物中去除某種類型細(xì)胞。如腫瘤細(xì)胞。②缺乏針對(duì)目的細(xì)胞篩選的特異性抗體磁珠時(shí)。③抗體和目的細(xì)胞結(jié)合可能誘導(dǎo)細(xì)胞活化，影響后續(xù)細(xì)胞功能分析時(shí)。復(fù)合分選：將陰性分選和陽(yáng)性分選相結(jié)合的分選方法。當(dāng)目的細(xì)胞含量特別低，無(wú)法直接進(jìn)行陽(yáng)性分選時(shí)，可采用陰性分選發(fā)先出去其他雜細(xì)胞，當(dāng)目的細(xì)胞富集到一定程度時(shí)在采用陽(yáng)性分選發(fā)篩選目的細(xì)胞。免疫磁珠與細(xì)胞解離1過(guò)夜培養(yǎng)法：常用方法。將結(jié)合磁珠細(xì)胞置于10%胎牛血清培養(yǎng)基中37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24h，磁珠可從細(xì)胞上脫落，再通過(guò)磁場(chǎng)除去游離磁珠，即可獲得裸細(xì)胞。2anti-Fab抗體法：用anti-Fab抗體與磁珠偶聯(lián)抗體競(jìng)爭(zhēng)目的細(xì)胞，是磁珠與目的細(xì)胞解離，用磁場(chǎng)除去游離磁珠，即可獲得非標(biāo)記細(xì)胞。3酶解法：通過(guò)木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠與細(xì)胞解離，再通過(guò)磁場(chǎng)除去游離磁珠，獲得裸細(xì)胞。免疫磁珠分離裝置

免疫磁珠分離裝置由超強(qiáng)磁鐵分離器和分離柱組成。磁鐵和分離柱的型號(hào)多樣，配合0.5ml、1.5ml微量離心管，15ml及50ml離心管或試管，和96孔或384孔培養(yǎng)板中樣品的分離，以滿足不同試驗(yàn)要求。十一免疫磁珠分離技術(shù)的應(yīng)用分離抗原抗體分離蛋白和多肽分離多糖物質(zhì)分離DNA和RNA分離細(xì)胞和病毒靶向釋藥系統(tǒng)的載運(yùn)食品有害微生物分析與檢測(cè)磁珠法分離抗體、抗原、蛋白、多肽、多糖、DNA、RNA操作過(guò)程示意圖μMACSVitalvirusHiv分離試劑盒分離標(biāo)記造血細(xì)胞表面的Hiv-1病毒CD44H異型細(xì)胞免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞示意圖免疫磁珠分離細(xì)胞及病毒示意圖十二免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用免疫磁珠對(duì)病毒細(xì)胞具有特異選擇性，因此能用于食品有害微生物的檢測(cè)。免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有檢測(cè)迅速、有選擇性分離目的微生物，有效減少背景干擾，提高了精準(zhǔn)性。同時(shí)還能捕獲受損傷靶細(xì)菌。目前，免疫磁珠技術(shù)已廣泛用于食品樣品中致病微生物的檢測(cè)。大腸桿菌O157的檢測(cè)傳統(tǒng)分離E.coliO157∶H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)。采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coliO157∶H7，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度。現(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國(guó)公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國(guó)也已將免疫磁珠法對(duì)大腸桿菌O157的檢測(cè)納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T4789.36-2008）和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1059.5-2006)。已有市售的專用免疫磁珠銷售。檢樣25g(mL)+225mL改良EC肉湯（mEC+n），均質(zhì)225mL免疫磁珠捕獲涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板挑取可疑菌落5個(gè)~10個(gè)，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSIMUG-LST陽(yáng)性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕獲法檢測(cè)O157∶H7程序陰性血清學(xué)試驗(yàn)非O157細(xì)菌生化試驗(yàn)報(bào)告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h1增菌

2免疫磁珠捕獲與分離

1.將Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后，用開(kāi)蓋器打開(kāi)每支Eppendo-rff管的蓋子，每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠懸液。

2.取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL，加人到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10s。每個(gè)樣品更換1支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行，避免交叉污染。

具體操作

3.結(jié)合:在18℃~30℃環(huán)境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在DynalMXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)10min，使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。4.捕獲:將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來(lái)，此時(shí)，在Eppendorff管壁中間明顯可見(jiàn)圓形或橢圓形棕色聚集物。

5.吸取上清液:取1支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管，從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過(guò)免疫磁珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸