第五章目的基因的獲取

第五章目的基因的獲取目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。一、限制性?xún)?nèi)切酶法用限制性?xún)?nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1.優(yōu)點(diǎn)2.缺點(diǎn)目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene1.限制性?xún)?nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開(kāi)。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。（1）限制性?xún)?nèi)切酶的選用原則1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個(gè)切點(diǎn)。隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連。（Sau3A—BamHI）（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷。1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié)化學(xué)合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動(dòng)化合成法。①保護(hù)dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或堿的脫保護(hù)原理1.磷酸二酯法②帶保護(hù)的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進(jìn)行。帶5’保護(hù)的單核苷酸與帶3’保護(hù)的另一個(gè)單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來(lái)。原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。2.磷酸三酯法3.固相磷酸三酯合成法

將第一個(gè)核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。是目前通用的合成方法。化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以?xún)?nèi)。二、化學(xué)合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個(gè)片段的5’端帶上磷酸。1.互補(bǔ)連接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補(bǔ)配對(duì)（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’5’5’3’5’3’T4DNA連接酶Klenow片段引物1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA

3.合成探針序列4.定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點(diǎn)人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor

將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。一、基因文庫(kù)的構(gòu)建1.基因文庫(kù)（genelibrary）第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增（2）目前常用的載體2.構(gòu)建基因文庫(kù)的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求

載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。

①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化。可得到10-30kb的隨機(jī)片斷。②酶切法：（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性?xún)?nèi)切酶粘性末端片斷。各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買(mǎi)。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1051.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱(chēng)cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱(chēng)cDNA文庫(kù)。（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。4.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）反轉(zhuǎn)錄酶①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH堿剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。DNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來(lái)合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶6.cDNA文庫(kù)的大小一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n第四節(jié)目的基因的分離和擴(kuò)增一、目的基因的分離1.探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來(lái)分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過(guò)柱與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜