嗜冷菌檢測(cè)方法

嗜冷菌檢測(cè)方法嗜冷菌概念牛乳擠出來(lái)要經(jīng)過(guò)冷卻處理，降低乳溫從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，但在低溫條件下有些細(xì)菌也能生長(zhǎng)，而這類(lèi)細(xì)菌即為低溫菌。低溫菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。嗜冷菌主要存在于低溫環(huán)境中，包括兩類(lèi)微生物，一類(lèi)是專(zhuān)性嗜冷菌（Psychrophiles最高生長(zhǎng)溫度不高于20°C，最適生長(zhǎng)溫度為15°C，在0°C仍然可以生長(zhǎng)繁殖的微生物；另一類(lèi)為兼性嗜冷菌（PsychrotrophicS，又名耐冷菌，最高生長(zhǎng)溫度高于20C，最適生長(zhǎng)溫度高于15°C，在0?5C仍然可以生長(zhǎng)繁殖的微生物。專(zhuān)性嗜冷菌主要分布在常冷低溫區(qū)，對(duì)溫度的變化比較敏感，20C以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范圍較寬，從常冷到不穩(wěn)定的低溫環(huán)境中都能分離到。方法一：基準(zhǔn)法一6?5°C,培養(yǎng)10天（仲裁法）范圍此方法用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗(yàn)。方法提要準(zhǔn)備好倒有培養(yǎng)基和定量稀釋適當(dāng)倍數(shù)的被測(cè)樣品的培養(yǎng)皿。。2.2將培養(yǎng)皿在6.5C條件下培養(yǎng)10天。根據(jù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)計(jì)算出每毫升樣品中的菌落數(shù)，選擇菌落數(shù)比較恰當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)比較得當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。試劑稀釋液生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液，滅菌。培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)瓊脂23.5g+脫脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要時(shí)用濾紙過(guò)濾。調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。在121土1°C下滅菌15min，如果培養(yǎng)基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1°C。如果不是，則為了不耽誤培養(yǎng)基的使用，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將培養(yǎng)基放入沸騰水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1°C。注：其中脫脂粉應(yīng)該不含有抑菌劑。儀器及玻璃器皿微生物實(shí)驗(yàn)室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：4.1培養(yǎng)箱，可以調(diào)節(jié)并保持到6.5±0.5CpH計(jì)，帶溫度補(bǔ)償，精度為0.14.3水浴，可以保持到46±1°C4.4三角瓶，250—300ml,帶合適的塞子。4.5吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。4.6培養(yǎng)皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm操作步驟5.1樣品的稀釋及培養(yǎng)5.1.1以無(wú)菌操作，將25ml樣品注入含有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶?jī)?nèi)，充分混勻，制成1：10的稀釋液。5.1.2用1ml滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分混勻，制成1：100的稀釋液。5.1.3另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支吸管。5.1.4根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇2—3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。注：其他稀釋方法可以使用，例如第一步稀釋可以是10ml檢測(cè)樣品注入到90ml稀釋液中，或11ml檢測(cè)樣品注入到99ml稀釋液中。當(dāng)樣品和稀釋液用量更大，方法的精密度和準(zhǔn)確度就更高。5.1.5稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46C的培養(yǎng)基（可放置于46±1C水浴保溫）注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將培養(yǎng)基傾入空的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。注：從稀釋樣品到傾倒培養(yǎng)基，整個(gè)操作過(guò)程不應(yīng)超過(guò)15min。5.1.6待培養(yǎng)基凝固，翻轉(zhuǎn)平板，放入6.5C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天。注：每疊皿不應(yīng)超過(guò)6個(gè)，每疊皿之間以及與培養(yǎng)箱的壁之間應(yīng)保持一定的間隙。菌落計(jì)數(shù)方法對(duì)平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)在柔和的光線(xiàn)下計(jì)數(shù)。為了便于計(jì)數(shù)，可使用適當(dāng)?shù)姆糯箸R和（或）菌落計(jì)數(shù)器。以防極小的菌落遺漏，以及避免將平皿中雜質(zhì)顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。仔細(xì)檢查可疑的物質(zhì)，如需要可使用更高倍數(shù)的放大鏡，以區(qū)別

菌落和外來(lái)物質(zhì)。菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告平板菌落數(shù)的選擇平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)若有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界限），若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。稀釋度的選擇及報(bào)告選取菌落數(shù)在10-300之間的培養(yǎng)皿作為計(jì)數(shù)的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)在10-300之間，則按下面的方法計(jì)數(shù)。計(jì)算每ml牛奶中微生物的個(gè)數(shù)N,用以下的公式：EcN=（n+0.1n）d12這里Ec：是所有皿上菌落數(shù)的總和。n:是第一個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)。1n:是第二個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)。2d：是與第一個(gè)稀釋液相對(duì)應(yīng)的稀釋因子結(jié)果保留兩位有效數(shù)字,后面的數(shù)字以四舍五入計(jì)算。當(dāng)?shù)谌粩?shù)是5時(shí),看其左邊的數(shù)是奇偶數(shù)進(jìn)行數(shù)字取舍；如28500進(jìn)行數(shù)字取舍為28000,11500為12000。結(jié)果以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示。舉例微生物計(jì)數(shù)給出以下的結(jié)果（包括兩個(gè)帶蓋培養(yǎng)皿）：在第一個(gè)稀釋度（10E-2）：168和215個(gè)菌落在第二個(gè)稀釋度（10E-3）：14和25個(gè)菌落Ec168+215+14+25422Ec168+215+14+25422=19182（n+0.1n）d[2+（0.1*2）]*10-20.02212根據(jù)上面所說(shuō)結(jié)果進(jìn)行取舍為19000,結(jié)果為1.9X104個(gè)/ml。注：如果有兩個(gè)以上可以計(jì)數(shù)的稀釋度，公式應(yīng)修改為用多個(gè)稀釋度進(jìn)行計(jì)算。如為三個(gè)稀釋度,由下面的公式可計(jì)算出每毫升中微生物的數(shù)量。EcN=（n1+0.1n2+0.01n3）d如果菌落數(shù)均小于10,則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù),報(bào)告每毫升牛奶菌落的估計(jì)數(shù)。如果菌落數(shù)均超過(guò)300,則按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù),報(bào)告每毫升牛奶菌落的估計(jì)數(shù)。6、參考標(biāo)準(zhǔn)IDF標(biāo)準(zhǔn)101A：1991——乳中嗜冷菌的檢驗(yàn)方法二：快速法一21°C，培養(yǎng)25h1范圍本標(biāo)準(zhǔn)描述的是通過(guò)21C時(shí)快速菌落計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行嗜冷菌菌數(shù)估算的方法。此方法用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗(yàn)—當(dāng)需要很快的得到嗜冷菌估算值的時(shí)候。2方法提要準(zhǔn)備好倒有培養(yǎng)基和定量稀釋適當(dāng)倍數(shù)的被測(cè)樣品的培養(yǎng)皿。2.2將培養(yǎng)皿在21C條件下培養(yǎng)25h。根據(jù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)計(jì)算出每毫升樣品中的菌落數(shù),選擇菌落數(shù)比較恰當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)比較得當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。3試劑稀釋液生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液,滅菌。培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)瓊脂23.5計(jì)脫脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要時(shí)用濾紙過(guò)濾。調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。在121±1°C下滅菌15min,如果培養(yǎng)基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1C。如果不是，則為了不耽誤培養(yǎng)基的使用，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將培養(yǎng)基放入沸騰水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1C。注：其中脫脂粉應(yīng)該不含有抑菌劑。4儀器及玻璃器皿微生物實(shí)驗(yàn)室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：4.1培養(yǎng)箱，可以調(diào)節(jié)并保持到21±1°CpH計(jì)，帶溫度補(bǔ)償，精度為0.14.3水浴，可以保持到46±1C4.4三角瓶，250—300ml，帶合適的塞子。4.5吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。4.6培養(yǎng)皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm5.操作步驟5.1樣品的稀釋及培養(yǎng)稀