嗜冷菌檢測方法

嗜冷菌檢測方法嗜冷菌概念牛乳擠出來要經(jīng)過冷卻處理，降低乳溫從而抑制細菌的生長繁殖，但在低溫條件下有些細菌也能生長，而這類細菌即為低溫菌。低溫菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。嗜冷菌主要存在于低溫環(huán)境中，包括兩類微生物，一類是專性嗜冷菌（Psychrophiles最高生長溫度不高于20°C，最適生長溫度為15°C，在0°C仍然可以生長繁殖的微生物；另一類為兼性嗜冷菌（PsychrotrophicS，又名耐冷菌，最高生長溫度高于20C，最適生長溫度高于15°C，在0?5C仍然可以生長繁殖的微生物。專性嗜冷菌主要分布在常冷低溫區(qū)，對溫度的變化比較敏感，20C以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范圍較寬，從常冷到不穩(wěn)定的低溫環(huán)境中都能分離到。方法一：基準法一6?5°C,培養(yǎng)10天（仲裁法）范圍此方法用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗。方法提要準備好倒有培養(yǎng)基和定量稀釋適當倍數(shù)的被測樣品的培養(yǎng)皿。。2.2將培養(yǎng)皿在6.5C條件下培養(yǎng)10天。根據(jù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)計算出每毫升樣品中的菌落數(shù)，選擇菌落數(shù)比較恰當?shù)南♂尡稊?shù)比較得當?shù)呐囵B(yǎng)皿進行菌落計數(shù)。試劑稀釋液生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液，滅菌。培養(yǎng)基平板計數(shù)瓊脂23.5g+脫脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要時用濾紙過濾。調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。在121土1°C下滅菌15min，如果培養(yǎng)基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1°C。如果不是，則為了不耽誤培養(yǎng)基的使用，在實驗開始前，將培養(yǎng)基放入沸騰水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1°C。注：其中脫脂粉應該不含有抑菌劑。儀器及玻璃器皿微生物實驗室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：4.1培養(yǎng)箱，可以調(diào)節(jié)并保持到6.5±0.5CpH計，帶溫度補償，精度為0.14.3水浴，可以保持到46±1°C4.4三角瓶，250—300ml,帶合適的塞子。4.5吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。4.6培養(yǎng)皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm操作步驟5.1樣品的稀釋及培養(yǎng)5.1.1以無菌操作，將25ml樣品注入含有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，充分混勻，制成1：10的稀釋液。5.1.2用1ml滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分混勻，制成1：100的稀釋液。5.1.3另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支吸管。5.1.4根據(jù)對樣品污染情況的估計，選擇2—3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。注：其他稀釋方法可以使用，例如第一步稀釋可以是10ml檢測樣品注入到90ml稀釋液中，或11ml檢測樣品注入到99ml稀釋液中。當樣品和稀釋液用量更大，方法的精密度和準確度就更高。5.1.5稀釋液移入平皿后，應及時將涼至46C的培養(yǎng)基（可放置于46±1C水浴保溫）注入平皿約15ml，并轉動平皿使混合均勻。同時將培養(yǎng)基傾入空的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。注：從稀釋樣品到傾倒培養(yǎng)基，整個操作過程不應超過15min。5.1.6待培養(yǎng)基凝固，翻轉平板，放入6.5C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天。注：每疊皿不應超過6個，每疊皿之間以及與培養(yǎng)箱的壁之間應保持一定的間隙。菌落計數(shù)方法對平皿進行菌落計數(shù)時，應在柔和的光線下計數(shù)。為了便于計數(shù)，可使用適當?shù)姆糯箸R和（或）菌落計數(shù)器。以防極小的菌落遺漏，以及避免將平皿中雜質顆粒進行計數(shù)。仔細檢查可疑的物質，如需要可使用更高倍數(shù)的放大鏡，以區(qū)別

菌落和外來物質。菌落計數(shù)的報告平板菌落數(shù)的選擇平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)若有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界限），若僅有一條鏈，可視為一個菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個菌落計。稀釋度的選擇及報告選取菌落數(shù)在10-300之間的培養(yǎng)皿作為計數(shù)的測定標準。若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)在10-300之間，則按下面的方法計數(shù)。計算每ml牛奶中微生物的個數(shù)N,用以下的公式：EcN=（n+0.1n）d12這里Ec：是所有皿上菌落數(shù)的總和。n:是第一個稀釋度培養(yǎng)皿的個數(shù)。1n:是第二個稀釋度培養(yǎng)皿的個數(shù)。2d：是與第一個稀釋液相對應的稀釋因子結果保留兩位有效數(shù)字,后面的數(shù)字以四舍五入計算。當?shù)谌粩?shù)是5時,看其左邊的數(shù)是奇偶數(shù)進行數(shù)字取舍；如28500進行數(shù)字取舍為28000,11500為12000。結果以科學計數(shù)法表示。舉例微生物計數(shù)給出以下的結果（包括兩個帶蓋培養(yǎng)皿）：在第一個稀釋度（10E-2）：168和215個菌落在第二個稀釋度（10E-3）：14和25個菌落Ec168+215+14+25422Ec168+215+14+25422=19182（n+0.1n）d[2+（0.1*2）]*10-20.02212根據(jù)上面所說結果進行取舍為19000,結果為1.9X104個/ml。注：如果有兩個以上可以計數(shù)的稀釋度，公式應修改為用多個稀釋度進行計算。如為三個稀釋度,由下面的公式可計算出每毫升中微生物的數(shù)量。EcN=（n1+0.1n2+0.01n3）d如果菌落數(shù)均小于10,則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù),報告每毫升牛奶菌落的估計數(shù)。如果菌落數(shù)均超過300,則按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù),報告每毫升牛奶菌落的估計數(shù)。6、參考標準IDF標準101A：1991——乳中嗜冷菌的檢驗方法二：快速法一21°C，培養(yǎng)25h1范圍本標準描述的是通過21C時快速菌落計數(shù)技術進行嗜冷菌菌數(shù)估算的方法。此方法用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗—當需要很快的得到嗜冷菌估算值的時候。2方法提要準備好倒有培養(yǎng)基和定量稀釋適當倍數(shù)的被測樣品的培養(yǎng)皿。2.2將培養(yǎng)皿在21C條件下培養(yǎng)25h。根據(jù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)計算出每毫升樣品中的菌落數(shù),選擇菌落數(shù)比較恰當?shù)南♂尡稊?shù)比較得當?shù)呐囵B(yǎng)皿進行菌落計數(shù)。3試劑稀釋液生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液,滅菌。培養(yǎng)基平板計數(shù)瓊脂23.5計脫脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要時用濾紙過濾。調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。在121±1°C下滅菌15min,如果培養(yǎng)基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1C。如果不是，則為了不耽誤培養(yǎng)基的使用，在實驗開始前，將培養(yǎng)基放入沸騰水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1C。注：其中脫脂粉應該不含有抑菌劑。4儀器及玻璃器皿微生物實驗室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：4.1培養(yǎng)箱，可以調(diào)節(jié)并保持到21±1°CpH計，帶溫度補償，精度為0.14.3水浴，可以保持到46±1C4.4三角瓶，250—300ml，帶合適的塞子。4.5吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。4.6培養(yǎng)皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm5.操作步驟5.1樣品的稀釋及培養(yǎng)稀