第五章.分子生物學(xué)的研究方法-DNA-蛋白質(zhì)相互作用

第六節(jié)研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法又叫做DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)，是80年代初出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。簡單、快捷，是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離是同其分子量的對(duì)數(shù)成反比，如果DNA分子結(jié)合上一種蛋白質(zhì)，那么由于分子量加大，在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，朝正電極移動(dòng)的距離也就相在縮短了。所以當(dāng)特定的DNA片段同細(xì)胞提取物混合之后，若其在凝膠電泳中的移動(dòng)距離變小了，這就說明它已同提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子發(fā)生了結(jié)合作用。2.6.1凝膠阻滯試驗(yàn)原理返回目錄返回第二章凝膠阻滯試驗(yàn)方法首先是用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段（亦稱探針DNA），然后同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，于是便有可能形成DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物。將它加樣到非變性的凝膠中，在控制使蛋白質(zhì)仍與DNA保持結(jié)合狀態(tài)的條件下進(jìn)行電泳分離，并應(yīng)用放射自顯影技術(shù)顯現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置。如果細(xì)胞層白質(zhì)提取物中不存在可同放射性標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么所有放射性標(biāo)己都將集中出現(xiàn)在凝膠的底部；反之，將會(huì)形成DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于凝膠阻滯的緣故，其特有的放射性標(biāo)記的探針DNA條帶就將滯后出現(xiàn)在較靠近凝膠頂部的位置。所以有的文獻(xiàn)中也稱這種試驗(yàn)為條帶阻滯試驗(yàn)（bandretardationassay）。凝膠阻滯試驗(yàn)用途鑒定特殊細(xì)胞提取物中，是否存在可同放射性標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)分子（比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等）研究發(fā)生此種結(jié)合作用之精確的DNA序列的特異性：其辦法是在DNA一蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中，加入超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA。如果競(jìng)爭(zhēng)同一種蛋白，由于競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA相比是極大超量的，絕大部分蛋白質(zhì)都會(huì)被其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合掉而使探針DNA處于自由狀態(tài)，自顯影圖片上不出現(xiàn)阻滯的條帶，相反，如果不競(jìng)爭(zhēng)同一蛋白，探針DNA仍與特定蛋白復(fù)合，呈現(xiàn)阻滯的條帶。使用競(jìng)爭(zhēng)DNA，可間接闡明體內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。如，使用一種具有與已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)DNA，就可以判斷檢測(cè)到的蛋白質(zhì)是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子，或是與之相關(guān)的其它轉(zhuǎn)錄因子；如果事先引入突變，可以檢測(cè)突變對(duì)其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響。2.6.2DNasel足跡試驗(yàn)盡管凝膠阻滯試驗(yàn)?zāi)軌蚪沂境鲈隗w內(nèi)發(fā)生的DNA蛋白質(zhì)之間相互作用的有關(guān)信息，然而它卻無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。要解答這個(gè)問題，則需要應(yīng)用DNasel足跡試驗(yàn)（footprintingassay）。它是一類用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。DNasel足跡試驗(yàn)過程首先是將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，并用限制酶去掉其中的一個(gè)末端，得到只一條鏈單末端標(biāo)記的雙鏈DNA分子體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。待二者結(jié)合之后，再加入少量的DNasel（它可沿著靶DNA作隨機(jī)單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達(dá)到平均每條鏈只發(fā)生一次磷酸二脂鍵的斷裂。如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特異蛋白質(zhì)，經(jīng)DNasel消化之后便會(huì)產(chǎn)生出距放射性標(biāo)記末端1個(gè)核苷酸、2個(gè)核苷酸、3個(gè)核苷酸等一系列前后長度均僅相差一個(gè)核苷酸的、不間斷的、連續(xù)的DNA片段梯度群體。從此混合物中除去蛋白質(zhì)之后，將DNA片段群體加樣在變性的DNA測(cè)序凝膠中進(jìn)行電泳分離，經(jīng)放射自顯影，便可顯現(xiàn)出相應(yīng)于DNasel切割產(chǎn)生的不同長度DNA片段組成的序列梯度條帶。但是，如果有一種蛋白質(zhì)已經(jīng)結(jié)合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么它就將保護(hù)這一區(qū)段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能產(chǎn)生出相應(yīng)長度的切割條帶。所以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位是沒有放射標(biāo)記條帶的，出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡”。足跡試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過足跡試驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合位點(diǎn)的分布狀況。如同凝膠阻滯試驗(yàn)一樣，也可以加入非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA，來消除特定的足跡，據(jù)此確定其核酸序列的特異性。DNasel足跡試驗(yàn)發(fā)展目前還出了若干種其它類型的足跡試驗(yàn)。例如，自由羥基足跡試驗(yàn)及菲咯琳銅足跡試驗(yàn)等。其中最有趣的是硫酸二甲脂（DMS）足跡試驗(yàn)。它所依據(jù)的原理是，DMS能夠促進(jìn)DNA中裸露的G甲基化，而六氫吡啶又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異的化學(xué)切割。假如有一種蛋白質(zhì)同DNA分子中的某一區(qū)段結(jié)合，在它的保護(hù)下，區(qū)域內(nèi)的G免受六氫吡啶的切割，于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具這些G殘基末端的DNA片段，故出現(xiàn)個(gè)空白區(qū)域，此即通常所說的足跡。與其它足跡試驗(yàn)不同，由于DMS足跡試驗(yàn)中被切割的是G殘基，因此可用來鑒定同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)段中的特異堿基。2.6.3甲基化干擾試驗(yàn)應(yīng)用甲基化干擾試驗(yàn)（methvlationinterferenceassay）技術(shù)，可以檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。甲基化干擾試驗(yàn)的具體操作先用硫酸二甲脂（DMS）處理靶DNA，控制反應(yīng)條件，使平均每條DNA分子只有一個(gè)G甲基化，而后將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結(jié)合蛋白的適當(dāng)?shù)募?xì)胞提取物一道溫育，并作凝膠阻滯試驗(yàn)。經(jīng)電泳分離之后，從凝膠中切取出具有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶和沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶，并用六氫吡啶處理之，于是甲基化的G殘基被切割，非甲基化的G殘基則不被切割。顯而易見，如果某個(gè)G因甲基化而不與蛋白質(zhì)結(jié)合，那么六氫吡啶對(duì)這個(gè)甲基化G殘基的