植物油DNA提取和基因檢測研究進(jìn)展

植物油DNA提取和基因檢測研究進(jìn)展齊玲倩瀏秀;丁夢璇瀏遠(yuǎn)遠(yuǎn);柯潤輝;尹建軍【摘要】MethodsforgenedetectionhavebeenwidelyusedintheauthenticationandGMOdetectionforvegetableoilsbecauseoftheirrapidity,efficiency,sensitivityandaccuracy.While,asforvegetableoils,thelowquantityandintegrityofDNAcausedbybeingrefinedincreasethedifficultiesofDNAextractionandgenedetection.Inthispaper,wereviewtheprogressofDNAextractionandgenedetectionforvegetableoilsandmakesomerespectfortheirfuture,soastoprovidetheoreticalreferencefortheresearchersinsomedegree.%基因檢測方法以其快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在植物油真實(shí)性和轉(zhuǎn)基因成分鑒定中。但植物油大都經(jīng)過精制加工，DNA含量極少且完整度低，這對植物油的基因提取和檢測造成了極大的困擾。本文對植物油DNA提取和基因檢測進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對以后的發(fā)展進(jìn)行了展望，以期為研究者提供一定的理論參考?！酒诳Q】《食品研究與開發(fā)》【年(卷)，期】2016(000)001【總頁數(shù)】5頁(P220-224)【關(guān)鍵詞】植物油;DNA提取;基因檢測【作者】齊玲倩瀏秀;丁夢璇瀏遠(yuǎn)遠(yuǎn);柯潤輝伊建軍【作者單位】中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015;中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015;中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015;中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015【正文語種】中文植物油是人類日常生活的重要組成部分，但是近年來植物油市場出現(xiàn)了較多的摻假植物油和轉(zhuǎn)基因植物油，例如摻雜大豆油、棕櫚油的花生油，摻雜榛子油、杏仁油、玉米油的橄欖油和轉(zhuǎn)基因大豆油，轉(zhuǎn)基因菜籽油等［1-2］，這嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益，侵犯了消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。為了保障消費(fèi)者的利益和權(quán)利，迫切需要對植物油的真實(shí)性和轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行鑒定。目前，植物油真實(shí)性的鑒定方法主要有色譜分析法、光譜分析法［3］和分子生物學(xué)方法，但是色譜分析法和光譜分析法都是基于理化成分的分析，容易受到季節(jié)、產(chǎn)地、生產(chǎn)條件等因素的影響，同時(shí)檢測限度較高（25%）,而分子生物學(xué)方法則更能反映原料的真實(shí)性，且快速、靈敏、準(zhǔn)確，因此在植物油真實(shí)性鑒定中應(yīng)用廣泛［4］。而植物油轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法也主要是分子生物學(xué)方法。分子生物學(xué)方法有基于蛋白質(zhì)和基于DNA的方法，但因?yàn)镈NA有較高的熱耐受性和酸堿耐受性，且在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，所以目前所使用的主要為基于DNA的分析方法。但是，經(jīng)過復(fù)雜的加工處理后，植物油的DNA降解為大小不一的碎片，且含量極低，這給植物油的基因提取和檢測造成了極大的困難［5-7］。近年來很多研究者對此進(jìn)行研究，并取得了一定的進(jìn)展，本文對這些進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，以期為研究者提供一定的理論參考。國內(nèi)外關(guān)于植物油DNA提取的報(bào)道，大多數(shù)采用試劑盒法提?。?-12］,但是因?yàn)榫珶捴参镉椭蠨NA含量少且完整度低，所以目前采用的試劑盒法均經(jīng)過改良，而改良一般針對油樣的前處理，目前研究較多的改良方法為乳化法、濃縮法及離心法。白立群等［13］先用等體積的無菌水對20mL大豆油進(jìn)行振蕩乳化，接著利用冷凍干燥的方法進(jìn)行濃縮，結(jié)果成功檢測到大豆的Lectin基因。程紅梅等［8］利用實(shí)驗(yàn)室自制試劑盒提取大豆油的DNA時(shí)，首先用10mL的正己烷對油樣進(jìn)行乳化，結(jié)果從10mL大豆油中提取出0.4pg高純度的DNA。Pasqualone［14］、Montemurro［15］、Alba［16］等在試劑盒提取之前都對橄欖油樣品進(jìn)行了離心分離，效果良好。根據(jù)何景［4］和JoanaCosta［17］的報(bào)道，在國外，應(yīng)用在植物油DNA提取中的試劑盒主要有theQiagenQIAampDNAstoolextractionkit、theNucleospinfoodkit、theWizardMagneticDNAPurificationSystem(Promega)forfood，其中，theWizardMagneticDNAPurificationSystem(Promega)Kit是應(yīng)用的較為廣泛的一種方法，主要原理是磁珠法，利用磁珠的磁性吸附核酸分子，而與油中的蛋白、脂肪、色素等雜質(zhì)分離開。但是對于完全精制的植物油，Costa等［18］比較了theNucleospinfoodkit和theWizardMagneticDNAPurificationSystem(Promega)forfood的DNA提取效果，發(fā)現(xiàn)theNucleospinfoodkit能從所有精制油樣中提取出可擴(kuò)增的DNA，而theWizardMagneticDNAPurificationSystem(Promega)forfood則不能，這與Zhang等［19］報(bào)道的利用theWizardMagneticDNAPurificationSystem(Promega)forfood不能提取出精煉大豆油的DNA相符。而在國內(nèi)，應(yīng)用在植物油DNA提取中的試劑盒主要為WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega)。覃文等［9］利用改良的WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega)從市售的玉米胚芽油，大豆色拉油中及混合油脂中提取出DNA，并擴(kuò)增出相應(yīng)的內(nèi)源基因。何偉麗等［10］也利用改良的WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega)從大豆色拉油中提取出了可擴(kuò)增出Lectin基因(118bp)的DNA。雖然現(xiàn)有的研究大多集中于各種試劑盒法提取植物油中的DNA，但是，試劑盒法造價(jià)較貴，因此出現(xiàn)了一些提取的新方法。白立群等［13］建立了一種有效的精煉大豆油DNA提取新方法-冷凍干燥法，他們將該方法的DNA提取效果與改良的theWizardMagneticDNAPurificationSystem(Promega)forfood的DNA提取效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥法的DNA富集效果以及檢測的靈敏度都高于試劑盒法。姚菲等［20］建立了一種有效的菜籽油DNA提取新方法-改進(jìn)的DNA法，他們將該改進(jìn)的DNA提取方法與冷凍干燥法、高鹽低pH法、改良SDS法、試劑盒法的DNA提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該改進(jìn)方法提取的DNA(OD260/OD280)純度為1.7~2.0，濃度達(dá)到10ng/pL,且適合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，效果最好。關(guān)于植物油DNA的提取，各種方法層出不窮，但是沒有一個(gè)公認(rèn)的、高效通用的提取方法。因此，發(fā)展高效通用的植物油DNA提取方法需要進(jìn)行更深層次的研究?；驒z測技術(shù)在植物油方面的應(yīng)用主要集中在2個(gè)研究方向：轉(zhuǎn)基因成分鑒定和真實(shí)性鑒定，植物油的真實(shí)性鑒定又包括摻假成分鑒定和原料品種鑒定2個(gè)方面［4］。2.1植物油轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分鑒定植物油轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分鑒定中常用的基因檢測技術(shù)有定性PCR法、PCR-GeneScan法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、多重巢式PCR法及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法［4-5］。2.1.1定性PCR法定性PCR法以其靈敏度高、簡便快捷的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于植物油的轉(zhuǎn)基因和摻假成分鑒定上［5］。程紅梅等［8］針對市場上出售的10種精煉大豆油DNA進(jìn)行35S、Nos、Epsps、Lectin基因的PCR檢測，其中，Lectin基因在10種大豆油中的擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性，其余3種基因在10種大豆油中也有陽性結(jié)果出現(xiàn)，這說明定性PCR法可以檢測到植物油的夕卜源基因。金紅等［21］針對兩個(gè)大豆色拉油品種的DNA進(jìn)行35S、Nos、Epsps、Lectin基因的PCR擴(kuò)增，結(jié)果這4種基因都出現(xiàn)了相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，且與轉(zhuǎn)基因大豆一致。王德蓮等［2］利用定性PCR法對摻有大豆油和棕櫚油的花生油進(jìn)行檢測，結(jié)果當(dāng)摻入的大豆油和花生油體積百分比達(dá)到10%時(shí)，該方法可以檢測到大豆油和棕櫚油的內(nèi)源基因。雖然定性PCR法靈敏簡便，但是其分辨率低、容易污染、較難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且凝膠電泳時(shí)使用有毒試劑（EB、GoldWell等），同時(shí)也無法進(jìn)行定量，這些方面限制了其在植物油轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分鑒定中的應(yīng)用。PCR-GeneScan法PCR-GeneScan法是在特異性擴(kuò)增反應(yīng)后，用測序儀器對產(chǎn)物進(jìn)行GeneScan掃描，可以區(qū)分相差一個(gè)堿基的DNA片段，省去了凝膠電泳檢測，方便、快捷。覃文等［9］針對市售的大豆油、玉米油及混合油進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，應(yīng)用PCR-GeneScan法，以大豆、玉米的內(nèi)源基因（Lectin、IVR）為質(zhì)控，檢測出了夕卜源的CrylA（b）和Epsps基因。相比于定性PCR法，該方法靈敏度較高，但是對操作人員及儀器設(shè)備的要求較高，普遍適用性不強(qiáng)。2.1.3實(shí)時(shí)熒光定量？。日法實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（簡稱qPCR），是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累來對整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比來達(dá)到對未知模板定量的要求。白立群等［13］對5種品牌大豆油的DNA進(jìn)行Lectin、CaMV35S和Nos基因的qPCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陽性，與商標(biāo)標(biāo)識(shí)一致。蔡翠霞等［22］對11種植物油的DNA進(jìn)行CaMV35S的qPCR擴(kuò)增，結(jié)果7種植物油的擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，與樣品的成分標(biāo)識(shí)一致。王德蓮等［2］利用qPCR法對摻有大豆油和棕櫚油的花生油進(jìn)行檢測，結(jié)果當(dāng)摻入的大豆油和花生油體積百分比達(dá)到10%時(shí)，該方法可以檢測到大豆油和棕油的內(nèi)源基因。qPCR法靈敏度高、特異性強(qiáng)、再現(xiàn)性好，與定性PCR相比，交叉污染幾率小、快捷、準(zhǔn)確，其最低檢測線可以達(dá)到pg級(jí)。但是，精準(zhǔn)定量不理想，對儀器設(shè)備要求較高，檢測費(fèi)用較高。2.1.4多重巢式？。日法多重巢式PCR法結(jié)合了巢式PCR的高靈敏度和多重PCR的快速、簡便和高特異性的特點(diǎn)，在植物油轉(zhuǎn)基因成分檢測中有一定的應(yīng)用。王澎等［23］對轉(zhuǎn)基因大豆油進(jìn)行檢測，單獨(dú)用二重巢式PCR的3對弓物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)并無明顯片段，經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后則獲得目的片段，證明二重巢式PCR可將含量較低的片段純化，提高反應(yīng)的特異性和靈敏性。敖金霞等［24］建立了五重巢式PCR對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻進(jìn)行PCR檢測，檢測靈敏度達(dá)到0.0005%。多重巢式PCR具有高通量、高特異性、高靈敏性的特點(diǎn)，但是其擴(kuò)增2次，很容易出現(xiàn)交叉污染而導(dǎo)致假陰性結(jié)果［4］。2.1.5環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法是一種恒溫核酸擴(kuò)增的新方法，該方法在恒溫條件下，利LAMP法比普通PCR法高2個(gè)~5個(gè)數(shù)量級(jí)［4］,對儀器要求較低，檢測成本少，操作及結(jié)果判定簡單，但是該方法引物設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)容易造成DNA污染，同時(shí)，蔡翠霞等［22］研究發(fā)現(xiàn)，對于食用植物油，LAMP檢測存在產(chǎn)生假陰性結(jié)果的可能。2.2植物油原料品種的鑒定分子標(biāo)記法具有共顯性、多態(tài)性高、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用在植物油原料品種的鑒定上。對于植物油原料品種的鑒定，目前研究最多的植物油為橄欖油。據(jù)報(bào)道，應(yīng)用在橄欖油原料品種鑒定上的分子標(biāo)記主要有：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD），擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP），簡單重復(fù)序列（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）［17］。但是考慮到精制植物油中DNA完整度極低，需要對這些方法進(jìn)行選擇，以確定高效的應(yīng)用于精制植物油原料品種鑒定的分子標(biāo)記。2.2.1RAPDRAPD操作簡單，花費(fèi)少，需要的植物基質(zhì)的量比較少，被廣泛應(yīng)用在植物研究中，近年來也有研究報(bào)道了其在橄欖油真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用。然而，Muzzalupo，Perri［26］利用RAPD對橄欖葉和橄欖油沉淀中的DNA進(jìn)行分子標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉中和油沉淀中的RAPD的結(jié)果并不一致。同樣，Martins-Lopes等［27］用RAPD引物對9個(gè)品系的橄欖油DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示7個(gè)品系的橄欖油DNA具有多態(tài)性，多態(tài)性水平為78%。對此，JoanaCosta等［17］認(rèn)為可能是由于橄欖油中DNA的完整度比較低，不能擴(kuò)增出足夠的指紋標(biāo)記來對其真實(shí)性進(jìn)行鑒定。由此看來，RAPD分子標(biāo)記對于精煉植物油中DNA完整度低的問題，并不能夠有效克服。AFLPAFLP是一種有效的多位點(diǎn)分子標(biāo)記，無需基因組的序列信息，具有較高的多態(tài)性和可靠性，被廣泛應(yīng)用在大量作物和野生物種的基因型分析。Busconi等［28］用AFLP對單品種橄欖油中的DNA進(jìn)行分析，結(jié)果顯示油中的DNA與從相同品系葉子中提取的DNA有高度的一致性。但是，AFLP技術(shù)操作極其復(fù)雜，而且很難分析獲得的大量條帶，不適合混合品種的橄欖油鑒定。同時(shí)，Pafundo等［29］強(qiáng)調(diào)了DNA的低完整性，會(huì)對AFLP的再現(xiàn)性產(chǎn)生較大的影響。這使得該技術(shù)在精煉植物油真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用受到一定的限制。SSRSSR屬于第三代分子標(biāo)記，多態(tài)性高，廣泛分布在植物基因組，辨別力強(qiáng)，是最可靠的分子標(biāo)記之一，應(yīng)用也最廣泛。RaydaBen-Ayed等［30］研究得出：利用SSR分子標(biāo)記建立的檢測方法可以對22種橄欖油品系進(jìn)行鑒定。Alba等［16］對橄欖葉的SSR指紋與相應(yīng)油的進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)SSR片段有85.7%的成功率，90%的試驗(yàn)結(jié)果顯示了葉和油SSR標(biāo)記的良好一致性。但是，SSR標(biāo)記所應(yīng)用的擴(kuò)增片段一般都比較短（小于300bp），而較長的片段則不總是被擴(kuò)增，使得其在較長片段上的應(yīng)用受到了限制。SNPSNP是近年來發(fā)展起來的第三代分子標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記相比，遺傳穩(wěn)定性高，位點(diǎn)豐富且分布廣泛，能區(qū)分個(gè)體間的微小不同，可有效應(yīng)用在橄欖油真實(shí)性鑒定上［31］。Consolandi等［32］利用SNP分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)了結(jié)合多重PCR與LDR-UA（連接酶測試反應(yīng)-通用芯片）的技術(shù)，利用該技術(shù)，他們可以區(qū)分49個(gè)橄欖品種。因此，SNP分子標(biāo)記有結(jié)合高通量技術(shù)的可能性，在進(jìn)行多樣品快速鑒定時(shí)，具有很大的優(yōu)勢。但是，SNP分子標(biāo)記的發(fā)展需要結(jié)合基因組序列信息的發(fā)展，而目前可用的序列信息量較少［33］。綜上所述，植物油DNA的質(zhì)量影響基因檢測的效率問題，是國內(nèi)夕卜研究的熱點(diǎn)。對于DNA的提取，應(yīng)用較多的為改良試劑盒法，但改良試劑盒法造價(jià)貴，且通用性差，一些DNA提取新方法花費(fèi)的成本雖少，但也存在通用性差的特點(diǎn)，而行標(biāo)法雖屬于通用的植物油DNA提取方法，但是其有效性不理想，因此，需要對其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。對于DNA的檢測，在轉(zhuǎn)基因成分和摻假成分的鑒定方面，定性PCR法、PCRGeneScan法、qPCR法的檢測結(jié)果容易受到精煉植物油DNA低含量和低完整度的影響，而出現(xiàn)假陰性，多重巢式？。日法和LAMP法靈敏度高，但多重巢式PCR容易出現(xiàn)交叉污染，LAMP法引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，擴(kuò)增產(chǎn)物處理時(shí)易污染，因此，靈敏度高、特異性好、操作簡單快捷、精準(zhǔn)定量、成本低的檢測技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。在植物油原料品種的鑒定上，分子標(biāo)記法具有共顯性、多態(tài)性高、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用在在植物油真實(shí)性鑒定上，其中RFLP和AFLP的再現(xiàn)性容易受到DNA低完整性的影響，SSR標(biāo)記的辨別力強(qiáng)，但是再現(xiàn)性容易受到大片段基因不總是被擴(kuò)增的影響，SNP標(biāo)記能區(qū)別個(gè)體間的微小不同，而且能夠結(jié)合高通量技術(shù)，可以適應(yīng)快速檢測的需要，是最實(shí)用的植物油DNA檢測的分子標(biāo)記。但是，目前，結(jié)合高通量技術(shù)的SNP分子標(biāo)記技術(shù)以及多種檢測方法結(jié)合或并用的技術(shù)還不成熟，需要進(jìn)行更深層次的研究?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】ArvanitoyannisIS,VlachosA.Implementationofphysicochemicalandsensoryanalysisinconjunctionwithmultivariateanalysistowardsassessingoliveoilauthentication/adulteration[J].CriticalReviewsinFoodScience&Nutrition,2007,47(5):441-498王德蓮，覃芳芳,曾國權(quán)，等.PCR方法檢測花生油摻假研究[J].糧食與油脂,2014,27(6):56-59宋玉峰，王微山,楊學(xué)軍，等.食用油摻假檢測方法研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng),2012,18(3):9-12何景,許文濤，黃昆侖.食用油DNA提取及檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技2012,33(12):382-386,391羅阿東，焦彥朝,曹云恒，等.食用植物油轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(9):470-472陳穎,王媛,徐寶梁，等.食品加工工藝對大豆內(nèi)源基因降解變化規(guī)律的影響[J].中國糧油學(xué)報(bào),2005,20(4):60-64姚芹，宋浩，陳楓.食用精煉大豆油DNA提取及單管巢式PCR檢測[J].食品工業(yè)科技,2013,34(21):183-186程紅梅，彭于發(fā),金蕪軍，等.一種快速、簡便提取大豆油DNA的方法及轉(zhuǎn)基因大豆油的檢測[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(5):1069-1072覃文,董潔,鄧鴻玲，等.PCR法定性檢測食用油脂中轉(zhuǎn)基因成分食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測[J].中國油脂,2002,27(2):4-6徐偉麗，杜明，徐德昌.色拉油中轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測[J].生物信息學(xué),2009,7(3):238-239,242許冬倩，郝義波.一種有效的油脂DNA的提取方法[J].食品研究與開發(fā),2008,29(10):42-45周紅霞，華春，張紅琳，等.PCR法定性檢測大豆食用油中轉(zhuǎn)基因成分[J].食品工業(yè)科技,2012,33(6):87-91白立群，吳亞君,韓建勛，等.一種有效的大豆精煉油DNA提取新方法-冷凍干燥法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(12):155-159PasqualoneA,MontemurroC,SummoC,etal.Effectivenesso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