人類外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備

細(xì)胞與遺傳學(xué)教研室人類染色體標(biāo)本的制作一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握人類染色體標(biāo)本的制作方法2.了解人類染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征二、實(shí)驗(yàn)原理外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都是處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物凝集素（PHA）時(shí)，小淋巴細(xì)胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并開(kāi)始進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)后，用秋水仙素處理、低滲、固定、滴片和染色，就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞，制片后可以清楚地對(duì)染色體進(jìn)行觀察.這種培養(yǎng)方法是Moorhead于1960年建立的。PHA37℃68h秋水仙素至72h外周血淋巴細(xì)胞G0期或G1期三、實(shí)驗(yàn)用品1.材料：人體外周血2.器材：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、離心機(jī)、刻度離心管、吸管、恒溫水浴鍋等3.試劑：培養(yǎng)基、秋水仙素（12.5μg∕ml）、植物凝集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低滲液、甲醇、冰乙酸、PH6.8磷酸緩沖液、Giemsa原液。四、實(shí)驗(yàn)方法1.外周血細(xì)胞培養(yǎng)（1）采血：無(wú)菌，肝素抗凝。用無(wú)菌注射器抽取肝素0.2ml,潤(rùn)濕針筒,推出多余肝素.消毒后,抽取受試者靜脈血2ml。）（2）接種培養(yǎng)：每培養(yǎng)瓶加入0.3～0.5ml（10滴）,

接種于裝有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，搖勻，

37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68小時(shí)。

（20滴）

（3）秋水仙素處理：0.05～0.4μg∕ml培養(yǎng)基，輕搖混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)。

實(shí)驗(yàn)方法2.染色體的制備（1）收獲細(xì)胞：用吸管吸取培養(yǎng)物，移至離心管中，以1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去上清液，留下沉淀物約0.3ml。

（2）低滲處理：加入預(yù)溫37℃的低滲液至8ml，用吸管輕吹打混勻，置于37℃恒溫水浴鍋中低滲20分鐘。低滲后吹打要輕,以防細(xì)胞破裂.（3）預(yù)固定：緩緩加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管輕吹打混勻。以1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，留約0.3ml沉淀物。

（4）固定：加入新鮮固定液至8ml，吸管吹打混勻，室溫固定