土壤綠僵菌分離方法的比較研究

土壤綠僵菌分離方法的比較研究

綠僵硬菌（粉末狀昆蟲）是優(yōu)良的寄生蟲，在預防和控制農(nóng)業(yè)害蟲方面得到了廣泛應用。土壤是綠僵菌宿存的重要場所,是綠僵菌資源的主要來源渠道,但因土壤中的大量非目標真菌,如黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(A.niger)、毛霉(Mucorracemosus)等與綠僵菌的生長條件相近,而且生長速度比綠僵菌快,常導致綠僵菌分離過程中大面積污染,影響分離效率。綠僵菌在土壤中的宿存和持續(xù)控制害蟲能力等研究中均涉及到從土壤中分離綠僵菌的過程,統(tǒng)計施放綠僵菌后的種群時空動態(tài),需能有效分離但不抑制綠僵菌生長的分離培養(yǎng)基,并能保證分離過程中綠僵菌的生長不受非目標菌的影響。因為生長條件和營養(yǎng)條件相似,真菌污染在綠僵菌分離過程中較易發(fā)生,在分離培養(yǎng)基中添加抗生素是控制綠僵菌污染的有效方式。目前市場上真菌抗生素主要有氨基糖苷類抗生素,如井岡霉素和春雷霉素;核苷類抗生素,如武夷菌素、多抗霉素、寧南霉素等;四環(huán)素類抗生素,如金霉素和土霉素;多烯類抗生素,如近年來應用較多的放線菌酮和兩性霉素B類;大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,如梧寧霉素;多醚類抗生素,如莫能菌素。本研究以土壤中6種非目標優(yōu)勢真菌和2種綠僵菌為供試菌,評價了3種真菌抗生素對目標菌和非目標菌的抑制作用,旨在篩選出對土壤中的優(yōu)勢真菌有較好抑制效果但不影響綠僵菌生長的抗生素種類和濃度,用于綠僵菌的分離。1材料和方法1.1各類菌株siga供試藥劑有伊曲康唑(西安楊森制藥有限公司生產(chǎn))、兩性霉素(Amresco公司生產(chǎn))、放線菌酮(Sigma公司生產(chǎn))。供試菌株有金龜子綠僵菌(M.anisopliae)Ma09和黃綠綠僵菌(M.flavoviride)FI985,均由廣東省林業(yè)科學研究院提供。1.2小鼠sda平板的制備土壤采集于廣東省內(nèi)的苗圃地、桉樹林地和松樹林地,獨立保存帶回實驗室進行分離。在無菌條件下,取5g土樣置于容量為100mL三角瓶內(nèi),加入0.3%吐溫-80無菌溶液50mL,200rpm下振蕩20min,靜置3min后,再取上層溶液,用無菌水進行連續(xù)4次10倍梯度稀釋,獲得5個濃度的菌懸液。取不同濃度的菌懸液100μL均勻涂于薩氏培養(yǎng)基(SDAY)平板(直徑為9cm),在(26±1)℃下暗培養(yǎng)3~4d,挑取單菌落點接于無菌的SDAY平板進行純化、鑒定。鑒定后轉(zhuǎn)接于SDAY斜面培養(yǎng)基,保存于廣東省林業(yè)科學研究院。1.33真菌抗生素的篩選毛霉、黃曲霉、黑曲霉、青霉(Penicilliumcommune)、擬青霉(Paecilomycesfumosa-roseus)、灰霉(Botrytisci-nerea)在土壤內(nèi)含菌量高、生長速度快,易造成綠僵菌分離時大面積污染,故選為真菌抗生素抑菌效果的測試對象。在SDAY培養(yǎng)基添加不同濃度伊曲康唑(5,10,25,50,100,200μg/mL)、兩性霉素(1,5,10,50,100,200μg/mL)和放線菌酮(1,5,10,20,50,100μg/mL),制成抑菌培養(yǎng)基平板(直徑為9cm)。用接種針挑取供試的6種真菌孢子(菌絲)點接于抑菌培養(yǎng)基平板中央,每處理5重復,(26±1)℃暗培養(yǎng)。以不加真菌抗生素的SDAY平板作對照(CK),接種后第3天起,每24h用十字交叉法測量各菌落直徑,至菌落長滿培養(yǎng)皿。計算3種真菌抗生素對各真菌的相對抑制率,將相對抑制率轉(zhuǎn)換成幾率值(Y)、藥劑濃度轉(zhuǎn)換成以10為底的對數(shù)值(lgx),做線性回歸,得毒力回歸方程(Y=algx+b)和相關(guān)系數(shù)(R),計算3種真菌抗生素對供試6種土壤非目標真菌生長的有效抑制濃度(EC50和EC90),結(jié)合相對抑制率評價真菌抗生素對6種非目標真菌抑制作用的強弱。相對抑制率A=(B-C)/B×100%式中,B為對照組菌落平均直徑(mm),C為處理組菌落平均直徑(mm)。1.43菌株對綠匹菌生長的影響在添加終濃度為200μg/mL的伊曲康唑、100μg/mL的兩性霉素和100μg/mL放線菌酮的SDAY培養(yǎng)基平板中央,分別點接金龜子綠僵菌Ma09和黃綠綠僵菌FI985孢子,每處理5個重復,(26±1)℃暗培養(yǎng),以不加真菌抗生素的SDAY培養(yǎng)基作對照,接種后采用十字交叉法每天測量綠僵菌菌落直徑,按1.3的方法計算相對抑制率,評價3種真菌抗生素對綠僵菌生長的影響。1.5處理數(shù)據(jù)應用DPS和Excel軟件進行方差分析、Duncan新復極差分析和毒力回歸分析。2結(jié)果與分析2.1種真菌的抑制率及毒力回歸分析2.1.1菌落生長趨勢不同濃度的伊曲康唑、兩性霉素和放線菌酮對供試的6種非目標真菌均有抑制作用,且真菌抗生素濃度越大菌落生長越慢。圖1~2是以黃曲霉、青霉和黑曲霉為例,在不同濃度的伊曲康唑、兩性霉素和放線菌酮作用下的生長變化趨勢。圖3~4表明,接種后第4天,3種真菌抗生素對6種非目標真菌均有抑制作用,同種抗生素對真菌的相對抑制率隨藥劑濃度的增加而提高。不同真菌抗生素對供試菌的抑菌效果差異明顯,伊曲康唑?qū)谇购兔沟囊种菩Ч^差,在濃度為100μg/mL時對其它4種真菌均有較好的抑制效果;兩性霉素對6種真菌的抑制效果較一致,對黃曲霉最佳,在濃度為100μg/mL時即可完全抑制其生長;放線菌酮對灰霉和擬青霉有較好抑制效果,在濃度為50μg/mL時即可完全抑制灰霉的生長。2.1.2相對抑制率分析伊曲康唑在測試濃度范圍內(nèi)均不能完全抑制供試菌的生長,對黃曲霉和青霉的抑制率要高于其他幾種供試菌,對青霉的抑制率平均超過70%;對黃曲霉的抑制率,除了5μg/mL濃度外,其他濃度達到70%以上(表1)。對毛霉和黑曲霉的抑制效果最差,對毛霉最高抑制率為54.84%。兩性霉素濃度為100μg/mL及以上可完全抑制黃曲霉的生長;濃度為25μg/mL時,對黑曲霉和灰霉抑制率分別為70.09%和73.73%。兩性霉素對毛霉的抑菌效果比伊曲康唑好,當濃度為100μg/mL時,抑制率為74.77%;當濃度為200μg/mL時對6種供試真菌的相對抑制率達到76%以上。放線菌酮對灰霉抑菌效果較好,濃度為50μg/mL時即可完全抑制灰霉的生長,1μg/mL也可達到61.9%的抑制率。當濃度達到50μg/mL時對黃曲霉和毛霉的抑制率達到90%以上,對于擬青霉和青霉也達70%以上。當濃度為100μg/mL時,對于6種供試菌抑菌率均達到75%以上,其中毛霉、擬青霉和灰霉均為100%。2.1.3毒力回歸分析3種抑菌劑對6種真菌的毒力回歸分析表明,各回歸方程均能較好的擬合(R>0.84)(表2)。抑制濃度(EC50,EC90)分析表明,3種真菌抗生素對供試6種真菌的抑制效果差異明顯。伊曲康唑?qū)η嗝埂M青霉、灰霉、黑曲霉和黃曲霉有較好的抑制效果,EC50分別為0.54,3.33,3.96,3.97,6.93μg/mL;對毛霉的抑制效果較差,EC50達90.57μg/mL。兩性霉素對毛霉的抑制效果比較差,對灰霉抑制效果最好,EC50僅為3.23μg/mL,對另外4種真菌的EC50為9.48~16.59μg/mL。放線菌酮對灰霉抑制效果最好,EC50為6.87μg/mL,而對于其他5種真菌抑制效果相當,EC50為13.82~27.43μg/mL。兩性霉素和放線菌酮濃度分別為35.28,27.43μg/mL時即對6種真菌可達到50%的相對抑制率。伊曲康唑作用于毛霉和兩性霉素作用于黑曲霉的EC90都極大,表明2種真菌抗生素無論濃度多大,對供試菌都不能百分百抑制。2.23兩性霉素作用下的菌落直徑接種后第3,4,5天,3種真菌抗生素作用下2株綠僵菌菌落直徑間均差異極顯著(P<0.01)(表3)。其中放線菌酮作用下的菌落直徑與對照差異不顯著;兩性霉素作用下除了第4天FI985菌株的菌落直徑與對照差異不顯著,其他處理均顯著小于對照;伊曲康唑作用下2株綠僵菌接種第3,4,5天的菌落直徑均顯著小于對照,結(jié)果表明伊曲康唑和兩性霉素對綠僵菌具有一定的抑制作用,且伊曲康唑大于兩性霉素,放線菌酮對綠僵菌的抑制作用不明顯。3不同微生物素對綠匹菌菌落生長的影響綜合伊曲康唑、兩性霉素和放線菌酮對灰霉、擬青霉、黃曲霉、黑曲霉、毛霉、青霉的生長抑制效果分析,兩性霉素和放線菌酮均能有效控制6種非目標真菌的污染,抑制效果比伊曲康唑好,且以放線菌酮為最優(yōu)。伊曲康唑?qū)G僵菌菌落生長的影響顯著大于兩性霉素和放線菌酮;放線菌酮作用下的綠僵菌菌落直徑與對照間差異不顯著,當濃度為27.43μg/mL時對6種供試非目標真菌的抑制率即達50%,濃度為50μg/mL時