五氯酚鈉對小鼠骨髓細胞微核的影響

五氯酚鈉對小鼠骨髓細胞微核的影響

氯酚鈉是一種廣泛使用的有機氯農藥。在世界范圍內，中國經常使用二氯酚鈉來控制日本吸血性疾病的流行，并取得了明顯的效果。五氯酚鈉具有良好的流動性，但由于自然界的分解緩慢、長期使用，尤其是濫用，造成了環(huán)境破壞。在中國長江中下游的11個省份、市、自治區(qū)，它被用于殺死指甲，并對環(huán)境造成了長期污染。近年來，隨著對五氯酚鈉毒性的深入研究，人們注意到它可以抑制生物代謝過程中氧化磷酸化的影響，并對肝臟、腎臟和中樞神經系統(tǒng)產生特別敏感的影響。許多國家嚴格限制了使用五氯酚鈉的范圍，但在中國，高效五氯酚鈉的使用也被廣泛應用于池塘的消毒。因此，對環(huán)境和生物環(huán)境的反應以及生物毒性的機制和潛在遺傳毒性的影響對環(huán)境保護和人類健康非常重要。它也是環(huán)境科學和生物科學活動的熱點之一。近年來國內外對五氯酚鈉的研究多集中在對動物尤其是水生生物的毒性.如Gagnon發(fā)現五氯酚鈉對幼年紅鯛魚有潛在的改變肝臟需氧厭氧代謝的作用;Florence等發(fā)現五氯酚鈉能夠通過增加感染的敏感性來影響海洋貝類的免疫系統(tǒng);施瑋等發(fā)現五氯酚鈉對發(fā)光細菌的EC50值隨著pH值和硬度的增加而增加,與水體中相同濃度的常規(guī)有機污染物相比,五氯酚鈉表現出更強的毒性.但是,五氯酚鈉對于植物的致突變性則未見報道,也并未見對魚類早期生命階段的毒性研究,不能全面評價五氯酚鈉在生態(tài)系統(tǒng)中的毒性.五氯酚鈉可能存在一定的遺傳毒性,但是目前對五氯酚鈉遺傳毒性研究的觀點不一.為了較全面評價五氯酚鈉的致突變性,本文采用不同生物材料(小鼠骨髓細胞、蠶豆根尖細胞和斑馬魚胚胎),在不同生物水平上(細胞水平和胚胎水平),觀察了五氯酚鈉對小鼠骨髓細胞微核率、蠶豆根尖微核率和斑馬魚胚胎發(fā)育的影響.1材料和方法1.1試驗材料1.1.1試驗藥物五氯酚鈉(sodiumpentachlorophenate),純度99%,中國環(huán)境科學研究院提供.1.1.2.松滋青皮豆和斑馬魚昆明種小鼠,體重18-22g,由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供.松滋青皮豆(Viciafaba),由華中師范大學生命科學院提供.斑馬魚(Brachydaniorerio),購于南京市花鳥市場.1.2測試方法1.1.1小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗根據文獻進行.不同劑量組的五氯酚鈉給藥2次,給藥間隔24h,末次給藥6h后,斷頸處死小鼠,按照常規(guī)方法制成骨髓涂片,吖啶橙(AO)染色,另設環(huán)磷酰胺陽性對照.在熒光顯微鏡下觀察計數,每組5只小鼠,每只小鼠觀察1000個嗜多染紅細胞(PCE),計算出有微核的嗜多染紅細胞(MNPCE‰),并進行統(tǒng)計分析.不設重復實驗.1.1.2改變劑對蠶根尖微核試驗.按照文獻進行.蠶豆經過浸種催芽后,各劑量組取生長良好的蠶豆進行根尖染毒,同時設置陰性對照(自來水)和陽性對照(環(huán)磷酰胺).染毒結束后,蠶豆經過根尖細胞恢復培養(yǎng)、根尖細胞固定、孚爾根(Feulgen)染色、制片,最后進行鏡檢.每個處理觀察5個根尖,每個根尖觀察1000個細胞,計算微核千分率(MCN‰),并進行統(tǒng)計分析.不設重復實驗.1.1.3斑馬魚胚胎發(fā)育試驗根據OECD(1998)標準方法進行.斑馬魚見光后即刻進行交配,給光30min后馬上收集魚卵,將其迅速暴露于受試溶液中并轉移至多孔培養(yǎng)皿中,每個濃度40個卵.迅速用倒置光學顯微鏡甄別受精卵與未受精卵,剔除未受精卵、分裂時呈明顯的不規(guī)則或是卵殼損傷的卵,及時補充健康受精卵.將多孔培養(yǎng)皿放置在恒溫光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照比為14h∶10h(晝/夜),進行斑馬魚胚胎發(fā)育培養(yǎng).用倒置顯微鏡觀察受精卵的4、8、12、24、36、48、72h發(fā)育情況,記錄發(fā)育過程中出現的一些具有代表性的毒理學終點和各種其他異?，F象.本試驗重復兩次.2結果2.1g對小鼠骨髓細胞微核試驗的影響實驗結果見表1.結果表明,除25mg/kg劑量組外,各個劑量組均能不同程度增加小鼠骨髓細胞的微核率,和對照組相比存在顯著性差異(P<0.05),并存在一定的劑量-效應關系.2.2改小鼠根尖細胞微核試驗實驗結果見表2.結果表明,各個劑量組均能不同程度增加蠶豆根尖細胞的微核率,最高劑量組5.0mg/L和對照組相比存在顯著性差異(P<0.01),且存在一定的劑量-效應關系.2.3tsk軟件致畸作用分析實驗結果見表3.結果表明:25℃時五氯酚鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育有明顯的致畸作用,由TSK軟件可算出72hEC50為515.3μg/L,95%置信區(qū)間為513.1-517.6μg/L.可以看出異常率隨暴露時間的延長和暴露劑量的增加表現出增大趨勢.3氯酚鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育的致突變性和致突變性的作用魏雪濤等觀察給藥劑量分別為25、50、100mg/kg,單次染毒24h和48h后小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核率,未發(fā)現有顯著性差異.本試驗采用的給藥方式有所不同:為兩次間隔24h,觀察到在25mg/kg劑量組,小鼠骨髓細胞微核率與對照相比沒有顯著性差異,可見五氯酚鈉在25mg/kg低劑量重復染毒后并不能誘發(fā)小鼠骨髓細胞微核.中劑量組50mg/kg和高劑量組100mg/kg在重復染毒后觀察到的小鼠骨髓細胞微核,與對照相比有顯著性差異,表明多次給藥能促進五氯酚鈉誘導小鼠骨髓微核細胞的產生,五氯酚鈉具有一定的致突變性.實驗結果表明,蠶豆根尖細胞微核只在最高濃度1mg/L組有極顯著性差異,可見五氯酚鈉可在較高的劑量水平引發(fā)蠶豆根尖微核的產生,從而具有一定的致突變性,而有關五氯酚鈉對蠶豆根尖微核率的影響國內外尚未見報道.斑馬魚胚胎發(fā)育試驗,OECD1998年將其列入測定單一化學品毒性的標準方法之一.采用斑馬魚胚胎發(fā)育試驗研究五氯酚鈉的致突變性在國內外文獻中未見報道.斑馬魚胚胎發(fā)育實驗與傳統(tǒng)的魚類急性毒性實驗相比,具有成本低、影響因素少、可重復性好等優(yōu)點,而且生命早期發(fā)育階段通常對毒性作用最敏感,利用其檢測水體中微量有機物的致突變性有很好的前景.試驗結果表明,在比較低的濃度(20μg/L),五氯酚鈉即能引發(fā)斑馬魚胚胎發(fā)育異常,具有一定的致突變性.觀察到五氯酚鈉對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響集中表現在胚胎發(fā)育后期,即48～72h間,可能與五氯酚鈉在胚胎中的蓄積有關.鄭敏、朱琳等發(fā)現五氯酚會對斑馬魚胚胎產生心胞囊腫、血液循環(huán)障礙、無心律、孵化率降低、停滯發(fā)育作用等急性毒性效應的敏感指標,0h染毒組的48hLC50為70.8μg/L.劉紅玲等研究表明,0h染毒組的斑馬魚胚胎發(fā)育48h和72h凝結的LC50均為300μg/L.本次試驗的48hLC>800μg/L,72hEC50為515.3μg/L,證明五氯酚鈉的毒性要遠小于五氯酚.五氯酚納在水體中部分降解為五氯酚,所以推斷本次試驗的斑馬魚胚胎發(fā)育異常有可能是五氯酚鈉與五氯酚共同作用所引發(fā)的.目前蠶豆根尖細胞微核監(jiān)測技術已成為國內外較為普遍用于研究和監(jiān)測環(huán)境致突變物(致癌物)的高等植物間期體細胞遺傳檢測系統(tǒng).1986年國家環(huán)保局已將蠶豆根尖細胞微核監(jiān)測技術列入《環(huán)境監(jiān)