fz第五章 分子生物學(xué)研究(上)

第五章分子生物學(xué)研究法(上)——DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)內(nèi)容提要：重組DNA技術(shù)回顧DNA基本操作技術(shù)RNA基本操作技術(shù)SNP的理論與應(yīng)用基因克隆技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)基因操作主要包括：DNA分子的切割與連接；核酸分子雜交；凝膠電泳；細(xì)胞轉(zhuǎn)化；核酸序列分析以及基因人工合成；定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等?；蚬こ蹋褐冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。5.1重組DNA技術(shù)回顧三大成就：在20世紀(jì)40年代Avery確定了基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；50年代末至60年代，提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō)，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。

重組DNA技術(shù)史上的主要事件（GMO轉(zhuǎn)基因生物）2003美國(guó)科學(xué)家完成狗基因組全序列測(cè)定中國(guó)科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測(cè)定2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成水稻基因組序列測(cè)定美、德、日、意、以科學(xué)家完成黑猩猩基因組全序列測(cè)定限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。雙酶切在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。如：病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種分子后，將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)菌（如：大腸桿菌）轉(zhuǎn)化，選擇轉(zhuǎn)化子，通過(guò)篩選，獲得DNA重組表達(dá)。并可在宿主細(xì)胞中保持下來(lái)，也可以完整的形式從細(xì)胞中被分離純化出來(lái)。重組DNA操作過(guò)程：

重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的主要工具酶5.2DNA操作技術(shù)核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。瓊脂糖是從瓊脂中提純到的。它由β-D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合形成的線性多聚糖。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時(shí)能凝膠化的特點(diǎn)，采用不同濃度的瓊脂糖溶液，成球后可得到不同孔徑的球狀凝膠，用于分離核苷酸類化合物。凝膠電泳的基本原理：一種分子被放置到電場(chǎng)中，就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。電泳遷移率與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子，在電場(chǎng)中向正極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此都能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對(duì)之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EtBr）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量，也可以被清晰地檢測(cè)出來(lái)。EB（Ethidiumbromide，溴化乙錠），分子式：C21H20BrN3，熔點(diǎn)：260-262°C，是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號(hào)，可用Polaroid底片或帶CCD成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。

溴化乙錠可以嵌入堿基分子中,導(dǎo)致錯(cuò)配。溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑,具有高致癌性!EB可以被皮膚吸收。做實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要帶手套。1嚴(yán)禁隨便丟棄。因?yàn)镋B是強(qiáng)致癌性，而且易揮發(fā)，揮發(fā)至空氣中，危害很大。

2廢EB溶液的處理方法

(1)對(duì)于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下處理：

a.將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml；

b.加入一倍體積的0.5mol/LKMnO4，混勻，再加入等量的25mol/LHCl，混勻，置室溫?cái)?shù)小時(shí)；

c.加入一倍體積的2.5mol/LNaOH，混勻并廢棄。

(2)EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：

a.按1mg/ml的量加入活性炭，不時(shí)輕搖混勻，室溫放置1小時(shí)；

b.用濾紙過(guò)濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。3廢EB接觸物，如抹布，槍頭。

一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期進(jìn)行焚燒處理。分離超大片段的DNA5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化：一種細(xì)菌菌株由于捕獲了另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株；接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株稱為受體菌株。大多數(shù)細(xì)菌，正常條件下轉(zhuǎn)化效率很低。為了高效轉(zhuǎn)化這些細(xì)菌，必需對(duì)受體細(xì)菌進(jìn)行一些理化處理，以增加它們獲取DNA的能力。經(jīng)歷了這種處理的細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。細(xì)菌轉(zhuǎn)化常用的方法：CaCl2法和電擊法CaCl2法：將快速生長(zhǎng)中的大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，使細(xì)胞膨脹形成原生質(zhì)球，與外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。42℃下做短暫熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。電擊法是細(xì)菌轉(zhuǎn)化的另一種高效法：由于轉(zhuǎn)化載體上一般帶有LacZ基因（大腸桿菌編碼β-半乳糖基酶），實(shí)驗(yàn)室常用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率的計(jì)算方法為：轉(zhuǎn)化體總數(shù)=菌落數(shù)×（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積）插入頻率=白色菌落數(shù)/(白色菌落數(shù)+藍(lán)色菌落數(shù)）轉(zhuǎn)化頻率（每μgDNA轉(zhuǎn)化菌落數(shù)）=轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒DNA總量(μg）。λ噬菌體作為克隆載體構(gòu)建基因文庫(kù)流程圖

細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法：含空載體的菌落為藍(lán)斑；含外源DNA的菌落為白斑；未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能在抗性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。5.2.3聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)是1985年問(wèn)世的一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。因?yàn)镈NA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)（“引導(dǎo)”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點(diǎn)由一小段寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)所決定。PCR反應(yīng)的全過(guò)程，即三步，可以被不斷重復(fù)：DNA解鏈（變性），引物與模板相結(jié)合（退火），DNA合成（鏈的延伸）。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n。PCR的主要步驟將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。然后降低反應(yīng)溫度（約50℃），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。最后，將反應(yīng)混合物的溫度上升到72度左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較。PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開(kāi)始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

PCR引物設(shè)計(jì)一對(duì)引物，與3′端互補(bǔ)長(zhǎng)度：15～30個(gè)核苷酸堿基分布隨機(jī)引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源性3′端必須互補(bǔ)5′端可游離5.2.4實(shí)時(shí)定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）實(shí)時(shí)定量PCR是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的基于PCR技術(shù)的利用不同的熒光檢測(cè)來(lái)給核酸定量的技術(shù)。具備了傳統(tǒng)PCR的優(yōu)點(diǎn)，又克服了傳統(tǒng)PCR的許多缺點(diǎn)。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念——Ct值。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在帶透明蓋的塑料小管中進(jìn)行，激發(fā)光可以直接透過(guò)管蓋，使其中的熒光探針被激發(fā)。熒光探針事先混合在PCR反應(yīng)液中，只有與DNA結(jié)合后，才能被激發(fā)出熒光。例如，熒光染料SYBRGreenⅠ，激發(fā)光波長(zhǎng)520nm，這種熒光染料只能與雙鏈DNA結(jié)合，并且只有在與DNA結(jié)合時(shí)，才能被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光染料SYBRGreenⅠ探針的實(shí)時(shí)定量PCR利用熒光染料SYBRGreenⅠ可以檢測(cè)PCR反應(yīng)中獲得的全部雙鏈DNA，但不能區(qū)分不同的雙鏈DNA。為了進(jìn)一步確保熒光檢測(cè)確實(shí)是靶DNA序列，人們又設(shè)計(jì)了只能與目的DNA序列特異結(jié)合的熒光探針，如TaqMan探針。這種探針是一小段被設(shè)計(jì)成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（50-150bp）。隨著PCR反應(yīng)進(jìn)行，這種探針結(jié)合到目的DNA序列上，并且會(huì)被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個(gè)切除而降解。被切下的熒光基團(tuán)會(huì)在激發(fā)光下發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度直接反映了擴(kuò)增靶DNA的總量。應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)5.25基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體結(jié)合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆（理論上每個(gè)序列至少有一份代表）。這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫(kù)。定義：指將某生物的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段，再與適合的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。

代表性是指文庫(kù)中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來(lái)可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫(kù)中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)很重要的指標(biāo)。文庫(kù)構(gòu)建采用兩個(gè)策略：一是采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來(lái)消化染色體DNA，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段DNA在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率均等；二是提高文庫(kù)所含基因組DNA的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來(lái)衡量。代表性和隨機(jī)性為預(yù)測(cè)一個(gè)完整基因組文庫(kù)應(yīng)包含克隆的數(shù)目，Clark和Carbon于1975年提出如下的計(jì)算公式：

N=ln（1-p）/ln（1-f）

N：代表一個(gè)完全基因組文庫(kù)所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)數(shù)；

p：表示所期望的目的基因在文庫(kù)中出現(xiàn)的幾率；

f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值；為了獲得整個(gè)基因簇或一個(gè)基因及其兩翼延伸序列，實(shí)驗(yàn)中所制備的DNA隨機(jī)片段一般約20kb或更大。以人為例，其基因組大小為3×109bp。若p=99%，平均插入片段大小為20kb，則N=6.9×105。構(gòu)建大片段基因組DNA文庫(kù)使用的載體主要有：λ噬菌體（λphage）；粘粒載體（cosmid）；細(xì)菌人工染色體（BacterialArtificialChromosomes,BAC）；酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosomes,YACs）；P1源人工染色體PAC。載體的選擇基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建流程基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建程序包含5個(gè)部分：①載體的制備；②高純度大分子量基因組DNA的提?。虎鄹叻肿恿?/p>

HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGEsizeselection）；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取和保存。5.3RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA非常龐大，而且含有大量重復(fù)序列，無(wú)論用電泳分離技術(shù)還是雜交方法都難以直接分離到靶基因片段。而cDNA來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，不含冗余序列，通過(guò)特異性的探針篩選cDNA文庫(kù)，可以較快的分離到相關(guān)基因。由于RNA分子敏感脆弱，自然狀態(tài)下難以擴(kuò)增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定cDNA，再插入到可以自我復(fù)制的載體中。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中cDNA的合成

逆轉(zhuǎn)錄酶核糖核酸酶DNA聚合酶cDNA：指以生物體的mRNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶在體外反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA分子。綠色：第一鏈藍(lán)色：第二鏈5.3.1總RNA的提取一個(gè)典型動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，特別是rRNA電泳后的3條特征條帶28S、18S和5SrRNA是鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。由于mRNA呈單鏈，容易受核酸酶的攻擊，所以RNA的操作比DNA操作更嚴(yán)格。操作要保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境、所用的器皿及溶液均沒(méi)有RNA酶的污染?？俁NA抽提方法很多，實(shí)驗(yàn)室常用異硫氰酸胍-苯酚抽提法。RNA的濃度和純度可以通過(guò)測(cè)定其OD260和OD280來(lái)判斷。OD260=1相當(dāng)于濃度為40μg；OD260/OD280=1.8-2.0，表示提取的純度較好；低于1.8，表明樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA與檢測(cè)DNA不同的是，RNA呈單鏈，易降解或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，需在變性劑如甲醛、尿素或加熱等條件下進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用來(lái)分析小相對(duì)分子質(zhì)量RNA。電泳后如果rRNA大小完整，且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2：1，mRNA分布均勻，則認(rèn)為RNA質(zhì)量較好5.3.2mRNA的純化mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征：5ˊ-m7G帽子，3ˊ-poly尾巴；實(shí)驗(yàn)中常用寡聚(dT)-纖維素柱色譜法純化mRNA。1、利用mRNA含有3ˊ-poly尾巴，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚(dT)-纖維素柱時(shí)，mRNA被特異性的結(jié)合在柱上；2、然后用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA；Promega公司的polyATTractmRNA分離系統(tǒng)：將生物素標(biāo)記的寡聚dT與細(xì)胞總RNA溫育，再加入微磁球相連的抗生物素蛋白以結(jié)合polyAmRNA,通過(guò)磁場(chǎng)吸附作用將polyAmRNA從總RNA中分離。PolyATtractmRNA的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖。5.3.3cDNA的合成cDNA文庫(kù)：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后，通過(guò)受體菌轉(zhuǎn)化，則每個(gè)受體菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。

從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA，通過(guò)酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，將雙鏈cDNA和載體連接，然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，

即可獲得cDNA文庫(kù)，構(gòu)建的cDNA文庫(kù)可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析；比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問(wèn)題?？傊甤DNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的基本手段。cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用的引物是oligodT（寡核苷酸dT），包含12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一個(gè)連接引物（通常為XhoⅠ等酶切位點(diǎn)）以便于克隆構(gòu)建。cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。

cDNA合成中的分子修飾。在cDNA合成過(guò)程中，應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶及甲基化dCTP；cDNA兩端應(yīng)加上不同內(nèi)切酶所識(shí)別的接頭序列，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。甲基化dCTP是為了保證cDNA鏈被甲基化修飾，防止構(gòu)建克隆時(shí)被限制性內(nèi)切酶切割。第二鏈cDNA的合成由DNA聚合酶催化：常用RNaseH切割mRNA-cDNA雜合鏈中的mRNA序列所產(chǎn)生