fz第五章 分子生物學研究(上)

第五章分子生物學研究法(上)——DNA、RNA及蛋白質操作技術內容提要：重組DNA技術回顧DNA基本操作技術RNA基本操作技術SNP的理論與應用基因克隆技術蛋白質組與蛋白質組學技術基因操作主要包括：DNA分子的切割與連接；核酸分子雜交；凝膠電泳；細胞轉化；核酸序列分析以及基因人工合成；定點突變和PCR擴增等?；蚬こ蹋褐冈隗w外將核酸分子插入病毒、質粒或其它載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ碳夹g強調了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。5.1重組DNA技術回顧三大成就：在20世紀40年代Avery確定了基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；50年代提出了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制，解決了基因的自我復制和世代交替問題；50年代末至60年代，提出了“中心法則”和操縱子學說，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。

重組DNA技術史上的主要事件（GMO轉基因生物）2003美國科學家完成狗基因組全序列測定中國科學家完成家蠶基因組全序列測定2005中、美、日科學家聯(lián)合完成水稻基因組序列測定美、德、日、意、以科學家完成黑猩猩基因組全序列測定限制性核酸內切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產生具有粘性末端的小片段。雙酶切在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上，才能在寄主細胞中進行繁殖。具備自主復制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。如：病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種分子后，將其重新導入到寄主細胞中，通過細菌（如：大腸桿菌）轉化，選擇轉化子，通過篩選，獲得DNA重組表達。并可在宿主細胞中保持下來，也可以完整的形式從細胞中被分離純化出來。重組DNA操作過程：

重組DNA實驗中常見的主要工具酶5.2DNA操作技術核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及研究蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段。瓊脂糖是從瓊脂中提純到的。它由β-D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結合形成的線性多聚糖。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時能凝膠化的特點，采用不同濃度的瓊脂糖溶液，成球后可得到不同孔徑的球狀凝膠，用于分離核苷酸類化合物。凝膠電泳的基本原理：一種分子被放置到電場中，就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。電泳遷移率與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子，在電場中向正極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此都能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量，也可以被清晰地檢測出來。EB（Ethidiumbromide，溴化乙錠），分子式：C21H20BrN3，熔點：260-262°C，是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠用標準302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號，可用Polaroid底片或帶CCD成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。

溴化乙錠可以嵌入堿基分子中,導致錯配。溴化乙錠是強誘變劑,具有高致癌性!EB可以被皮膚吸收。做實驗時一定要帶手套。1嚴禁隨便丟棄。因為EB是強致癌性，而且易揮發(fā)，揮發(fā)至空氣中，危害很大。

2廢EB溶液的處理方法

(1)對于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下處理：

a.將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml；

b.加入一倍體積的0.5mol/LKMnO4，混勻，再加入等量的25mol/LHCl，混勻，置室溫數(shù)小時；

c.加入一倍體積的2.5mol/LNaOH，混勻并廢棄。

(2)EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：

a.按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時；

b.用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。3廢EB接觸物，如抹布，槍頭。

一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期進行焚燒處理。分離超大片段的DNA5.2.2細菌轉化與目標DNA分子的增殖細菌轉化：一種細菌菌株由于捕獲了另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉化DNA的菌株叫作供體菌株；接受轉化DNA的細菌菌株稱為受體菌株。大多數(shù)細菌，正常條件下轉化效率很低。為了高效轉化這些細菌，必需對受體細菌進行一些理化處理，以增加它們獲取DNA的能力。經歷了這種處理的細胞被稱作感受態(tài)細胞（competentcells）。細菌轉化常用的方法：CaCl2法和電擊法CaCl2法：將快速生長中的大腸桿菌置于經0℃預處理的低滲CaCl2溶液中，使細胞膨脹形成原生質球，與外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。42℃下做短暫熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。在培養(yǎng)基中生長一段時間使轉化基因實現(xiàn)表達，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉化子。電擊法是細菌轉化的另一種高效法：由于轉化載體上一般帶有LacZ基因（大腸桿菌編碼β-半乳糖基酶），實驗室常用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結合α-互補藍白斑篩選法鑒定轉化細胞。感受態(tài)細胞轉化頻率的計算方法為：轉化體總數(shù)=菌落數(shù)×（轉化反應原液總體積/涂板菌液體積）插入頻率=白色菌落數(shù)/(白色菌落數(shù)+藍色菌落數(shù)）轉化頻率（每μgDNA轉化菌落數(shù)）=轉化體總數(shù)/加入質粒DNA總量(μg）。λ噬菌體作為克隆載體構建基因文庫流程圖

細菌轉化及藍白斑篩選藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法：含空載體的菌落為藍斑；含外源DNA的菌落為白斑；未轉化的細菌不能在抗性培養(yǎng)基上生長。5.2.3聚合酶鏈反應技術聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction，PCR)是1985年問世的一種體外擴增DNA片段的技術。首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補鏈。因為DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動（“引導”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點由一小段寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點所決定。PCR反應的全過程，即三步，可以被不斷重復：DNA解鏈（變性），引物與模板相結合（退火），DNA合成（鏈的延伸）。經多次循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應是2n。PCR的主要步驟將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。然后降低反應溫度（約50℃），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上。最后，將反應混合物的溫度上升到72度左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補鏈。PCR的基本原理變性、復性、半保留復制PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR指數(shù)擴增時循環(huán)次數(shù)與DNA產物數(shù)量的比較。PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

PCR引物設計一對引物，與3′端互補長度：15～30個核苷酸堿基分布隨機引物內、引物間不應有互補序列引物與非特異擴增區(qū)無同源性3′端必須互補5′端可游離5.2.4實時定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）實時定量PCR是20世紀90年代中期發(fā)展起來的基于PCR技術的利用不同的熒光檢測來給核酸定量的技術。具備了傳統(tǒng)PCR的優(yōu)點，又克服了傳統(tǒng)PCR的許多缺點。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念——Ct值。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)。實時定量PCR反應在帶透明蓋的塑料小管中進行，激發(fā)光可以直接透過管蓋，使其中的熒光探針被激發(fā)。熒光探針事先混合在PCR反應液中，只有與DNA結合后，才能被激發(fā)出熒光。例如，熒光染料SYBRGreenⅠ，激發(fā)光波長520nm，這種熒光染料只能與雙鏈DNA結合，并且只有在與DNA結合時，才能被激發(fā)產生熒光。熒光染料SYBRGreenⅠ探針的實時定量PCR利用熒光染料SYBRGreenⅠ可以檢測PCR反應中獲得的全部雙鏈DNA，但不能區(qū)分不同的雙鏈DNA。為了進一步確保熒光檢測確實是靶DNA序列，人們又設計了只能與目的DNA序列特異結合的熒光探針，如TaqMan探針。這種探針是一小段被設計成可以與靶DNA序列中間部位結合的單鏈DNA（50-150bp）。隨著PCR反應進行，這種探針結合到目的DNA序列上，并且會被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個切除而降解。被切下的熒光基團會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，熒光強度直接反映了擴增靶DNA的總量。應用TaqMan探針實時定量PCR技術5.25基因組DNA文庫構建把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與載體結合，導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€序列至少有一份代表）。這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫。定義：指將某生物的全部基因組DNA用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度的DNA片段，再與適合的載體在體外重組并轉化相應的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。

代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫質量的一個很重要的指標。文庫構建采用兩個策略：一是采用部分酶切或隨機切割的方法來消化染色體DNA，以保證克隆的隨機性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；二是提高文庫所含基因組DNA的總容量，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。代表性和隨機性為預測一個完整基因組文庫應包含克隆的數(shù)目，Clark和Carbon于1975年提出如下的計算公式：

N=ln（1-p）/ln（1-f）

N：代表一個完全基因組文庫所應該包含的重組克隆個數(shù)；

p：表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的幾率；

f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值；為了獲得整個基因簇或一個基因及其兩翼延伸序列，實驗中所制備的DNA隨機片段一般約20kb或更大。以人為例，其基因組大小為3×109bp。若p=99%，平均插入片段大小為20kb，則N=6.9×105。構建大片段基因組DNA文庫使用的載體主要有：λ噬菌體（λphage）；粘粒載體（cosmid）；細菌人工染色體（BacterialArtificialChromosomes,BAC）；酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosomes,YACs）；P1源人工染色體PAC。載體的選擇基因組DNA文庫的構建流程基因組DNA文庫的構建程序包含5個部分：①載體的制備；②高純度大分子量基因組DNA的提??；③高分子量

HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離（PFGEsizeselection）；④載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞；⑤重組克隆的挑取和保存。5.3RNA基本操作技術真核生物基因組DNA非常龐大，而且含有大量重復序列，無論用電泳分離技術還是雜交方法都難以直接分離到靶基因片段。而cDNA來自反轉錄的mRNA，不含冗余序列，通過特異性的探針篩選cDNA文庫，可以較快的分離到相關基因。由于RNA分子敏感脆弱，自然狀態(tài)下難以擴增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉錄成穩(wěn)定cDNA，再插入到可以自我復制的載體中。逆轉錄過程中cDNA的合成

逆轉錄酶核糖核酸酶DNA聚合酶cDNA：指以生物體的mRNA為模板，用逆轉錄酶和聚合酶在體外反轉錄合成雙鏈DNA分子。綠色：第一鏈藍色：第二鏈5.3.1總RNA的提取一個典型動物細胞約含10-5μgRNA，特別是rRNA電泳后的3條特征條帶28S、18S和5SrRNA是鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。由于mRNA呈單鏈，容易受核酸酶的攻擊，所以RNA的操作比DNA操作更嚴格。操作要保證實驗環(huán)境、所用的器皿及溶液均沒有RNA酶的污染?？俁NA抽提方法很多，實驗室常用異硫氰酸胍-苯酚抽提法。RNA的濃度和純度可以通過測定其OD260和OD280來判斷。OD260=1相當于濃度為40μg；OD260/OD280=1.8-2.0，表示提取的純度較好；低于1.8，表明樣品中有蛋白質或酚污染。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA與檢測DNA不同的是，RNA呈單鏈，易降解或形成二級結構，需在變性劑如甲醛、尿素或加熱等條件下進行。聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用來分析小相對分子質量RNA。電泳后如果rRNA大小完整，且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2：1，mRNA分布均勻，則認為RNA質量較好5.3.2mRNA的純化mRNA分子最顯著的結構特征：5ˊ-m7G帽子，3ˊ-poly尾巴；實驗中常用寡聚(dT)-纖維素柱色譜法純化mRNA。1、利用mRNA含有3ˊ-poly尾巴，當RNA流經寡聚(dT)-纖維素柱時，mRNA被特異性的結合在柱上；2、然后用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA；Promega公司的polyATTractmRNA分離系統(tǒng)：將生物素標記的寡聚dT與細胞總RNA溫育，再加入微磁球相連的抗生物素蛋白以結合polyAmRNA,通過磁場吸附作用將polyAmRNA從總RNA中分離。PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖。5.3.3cDNA的合成cDNA文庫：以mRNA為模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA，與適當?shù)妮d體（常用噬菌體或質粒載體）連接后，通過受體菌轉化，則每個受體菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。

從真核生物的組織或細胞中提取mRNA，通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，將雙鏈cDNA和載體連接，然后轉化擴增，

即可獲得cDNA文庫，構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析；比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題?？傊甤DNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉錄成cDNA。反轉錄由反轉錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導，常用的引物是oligodT（寡核苷酸dT），包含12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一個連接引物（通常為XhoⅠ等酶切位點）以便于克隆構建。cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。

cDNA合成中的分子修飾。在cDNA合成過程中，應選用活性較高的反轉錄酶及甲基化dCTP；cDNA兩端應加上不同內切酶所識別的接頭序列，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。甲基化dCTP是為了保證cDNA鏈被甲基化修飾，防止構建克隆時被限制性內切酶切割。第二鏈cDNA的合成由DNA聚合酶催化：常用RNaseH切割mRNA-cDNA雜合鏈中的mRNA序列所產生