基因工程載體2013

第四章基因工程載體

§1概述§2克隆載體§3

大腸桿菌表達(dá)載體第一節(jié)概述載體（vector）是指將外源DNA或基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。按功能:克隆載體和表達(dá)載體，表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)載體。

克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強啟動子；按工作方式:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等。按受體細(xì)胞:原核細(xì)胞載體和真核細(xì)胞載體。載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。第二節(jié)克隆載體克隆載體(cloningvector)：是指用于擴(kuò)增或保存外源DNA片段而設(shè)計的載體。克隆載體的結(jié)構(gòu)特征多克隆位點(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr克隆載體具備的條件①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。②載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點，即多克隆位點。③載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因。④載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。⑤載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。⑥載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。⑦載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。⑧載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載體,主要用于原核生物和動植物的基因轉(zhuǎn)移以及建立基因文庫和cDNA文庫。1.質(zhì)粒(plasmid)的概念：獨立于染色體外能夠進(jìn)行自我復(fù)制的雙鏈DNA分子。天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀(cccDNA)、開環(huán)(ocDNA)和線性(lDNA)構(gòu)型。

Plasmidchromosome

ccc2.質(zhì)粒的生物學(xué)特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài),但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。(2)質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后,可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù):是指每個宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個宿主細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒(拷貝數(shù)少，為1-5個)與松弛型復(fù)制質(zhì)粒(拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個拷貝)。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。(4)質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)：兩種不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。(親緣關(guān)系密切的,野生型和其衍生質(zhì)粒。)3.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量(降低載體長度)，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因,如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。4.標(biāo)記基因標(biāo)記基因按其用途分為2類：選擇標(biāo)記基因:用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標(biāo)記基因:用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。4.1選擇標(biāo)記基因4.2篩選標(biāo)記基因(1)α-互補(α-complementation)是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的LacZ基因的突變體之間實現(xiàn)互補，從而產(chǎn)生具有β-半乳糖苷酶學(xué)活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為α-互補。

(2)插入失活(insertionalinactivation)

在質(zhì)粒pBR322的抗四環(huán)素基因上插入一個外源基因后，導(dǎo)致抗四環(huán)素基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性，這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源基因片段插入到載體中，這種篩選方法稱為插入失活。

抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)

5常用質(zhì)?？寺≥d體5.1pSC101質(zhì)粒載體

一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個寄主細(xì)胞僅有1~2個拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr

）。有HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、PvuⅡ、SmaⅠ7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ3個位點克隆外源DNA，都會導(dǎo)致tetr基因失活。是第一個真核生物的克隆載體。pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。許多實用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成。可見其原型質(zhì)粒在使用上有優(yōu)點。

5.2pBR322“pBR322”這個名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示最初構(gòu)建它的實驗室(BR代表了兩個構(gòu)建人的名字：Bolivar和Rodriguez)“322"把該質(zhì)粒和該實驗室構(gòu)建的其他質(zhì)粒區(qū)分開來(另外還有pBR325，pBR327，pBR328pBR322的結(jié)構(gòu)來源pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點：(1)、具有較小的分子量；

它的分子量為4363bp。意味著可以很容易純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組DNA分子。即使添加上6kb的DNA鏈，重組的pBR322的大小仍在可操作的范圍內(nèi)(＜10kb)。(2)、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。其中7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點，pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)志的選擇(3)、具有較高的拷貝數(shù)。

通常在被轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌中有大約15個pBR322質(zhì)粒分子；而且經(jīng)過蛋白質(zhì)合成抑制劑（氯霉素擴(kuò)增）之后每個細(xì)胞中可積累1000~3000個拷貝，這樣，通過培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大量重組過的pBR322質(zhì)粒分子。5.3pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的，其組成如下：含有pBR322完整的Ampr基因和復(fù)制起始點。含有大腸桿菌

-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，即lacZ’基因。在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點：具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個細(xì)胞可達(dá)500-700個拷貝。適用于組織化學(xué)方法檢測重組體,有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。5.4T-載體6質(zhì)?？寺≥d體的用途

用于保存和擴(kuò)增片段小于2kb的目的基因。構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫?？捎糜谀康幕虻臏y序。作為核酸雜交時探針的來源。二、λ噬菌體載體

噬菌體的研究歷史，是同分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展過程密切相關(guān)的。DNA復(fù)制機(jī)理的闡明、轉(zhuǎn)錄的終止作用、連接酶和解旋酶的發(fā)現(xiàn)、位點特異的重組作用、SOS修復(fù)機(jī)制等，均是以噬菌體為材料取得的重要研究成果。依據(jù)噬菌體的復(fù)制和生活周期等特點，已經(jīng)構(gòu)建了許多噬菌體載體，并廣泛用于基因克隆、基因文庫的構(gòu)建等，是基因工程中不可缺少的實驗材料。

噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。λ噬菌體侵犯細(xì)菌時，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖。λ噬菌體在宿主內(nèi)進(jìn)行獨立復(fù)制，在1個菌體內(nèi)生長出100個左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細(xì)菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原。λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細(xì)菌-獨立復(fù)制-裂解（沖破細(xì)胞膜）-再感染其他細(xì)菌。

λ噬菌體的生活周期：

λ噬菌體整個基因組分3部分:①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長約20kb,是λDNA整合和切出,溶原生長所需序列。③右臂：長約10kb,是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)。λ噬菌體DNA的兩個5′末端為12bp的單鏈，兩端序列互補成為天然的“粘性末端”。λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主菌體后，通過兩個末端互補結(jié)合而形成粘性末端位點（cohesiveendsite，即粘性末端位點之意,簡稱cos位點）整個DNA分子環(huán)化。 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearform1λ-DNA載體的構(gòu)建1.1縮短長度

野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。1.2刪除重復(fù)的酶切位點野生型的λ-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1-2個；同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點；除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點。1.3加裝選擇標(biāo)記

與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是λ-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容λ-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記(1)加裝選擇標(biāo)記imm434

imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的λ-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。(2)加裝選擇標(biāo)記lacZ

lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。1.4構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λ-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λ-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。1.5λ-DNA重組分子的體外包裝λ