區(qū)試DNA培訓-趙久然

中國玉米標準DNA指紋庫構建

北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心

趙久然推廣情況

≧5萬畝品種約300個≧100萬畝品種約60個審定情況

已國審品種約200個已審定品種1000多個

每年新審定品種數(shù)以百計每年參加國家及省區(qū)試品種數(shù)以千計保護情況

已獲得品種權的品種400多個已申請品種權的品種1000多個自1999年，每年新申請保護品種數(shù)量逐年上升一、國內(nèi)玉米品種現(xiàn)狀形態(tài)鑒定為主，同工酶和蛋白電泳鑒定為輔品種劇增遺傳基礎狹窄迫切需要開發(fā)新的鑒定技術RFLPRAPDAFLPSSRSNPDNA指紋檢測試劑盒DNA指紋技術DNA指紋檢測國家標準

標準DNA指紋庫二國內(nèi)玉米品種鑒定現(xiàn)狀

建立DUS測試中心測試中心1個測試分中心14個

編制玉米品種測試指南測試基本性狀49個選擇性狀11個選用標準品種約50個三、國內(nèi)玉米DUS測試情況多態(tài)性高，較少的標記就可滿足特異性鑒定的需要測試周期短，不受季節(jié)的限制，任何時間都可進行測試，可大大縮短品種權從申請到授權的時間間隔屬中性變異，與形態(tài)性狀無直接關系，因而不受育種者選擇傾向的影響可選擇的標記數(shù)量多，完全可以適應品種數(shù)量不斷增多的要求不受環(huán)境的影響不必提供選育系譜不必針對自交系和雜交種制定不同的標準不必使用標準品種和對照品種四、分子標記應用于DUS

測試中的優(yōu)勢5五、承擔玉米DNA指紋鑒定相關研究項目分子標記技術在玉米新品種選育及種質(zhì)鑒定中的應用研究（北京市重點、國家科委重點及地方攻關，1995-1999）應用分子標記選配強優(yōu)勢玉米雜交組合新方法研究（北京市科技新星,1995-1998）玉米種子DNA指紋純度及真?zhèn)舞b定技術應用推廣（北京市農(nóng)委,1999-2000）華北農(nóng)作物核心種質(zhì)資源研究與利用（北京市科委重大,2001-2004）應用分子標記技術進行玉米親子鑒定研究（北京市科技新星,2001-2004）玉米DNA指紋鑒定試劑盒的開發(fā)（北京市科技新星,2003-2005）中國玉米新品種DNA指紋庫構建研究（北京市科委重點,2003-2005）玉米品種權保護中的分子標記技術研究（國家百千萬人才，2005-2007）超級玉米種質(zhì)創(chuàng)新及中國玉米標準DNA指紋庫構建（北京農(nóng)業(yè)育種基礎研究創(chuàng)新平臺，2005-2007）玉米品種DNA指紋鑒定方法（農(nóng)業(yè)部標準，2004-2005）玉米品種純度SSR檢測方法（國家標準，2004-2005）玉米品種資源收集及新品種選育（2005.1-2007.12，北京市科委重大）玉米第六染色體抗病基因富集區(qū)域的功能基因組學研究（2006.1－2008.12，北京市自然基金重大）基于毛細管電泳五色熒光系統(tǒng)的高通量玉米核心引物復合擴增體系的建立

(2007.1-2009.12,青年骨干人才)六、目前研究現(xiàn)狀情況1.通過各種標記方法比較

確定選用SSR標記

分子標記的類型各種分子標記方法比較項目RFLPRAPDSSRAFLP多態(tài)性程度中中高中遺傳特性共顯性顯性共顯性顯性位點檢測頻率1-25-20130-100DNA質(zhì)量要求高低低高DNA用量多少少多同位素使用是/否否否是/否帶型統(tǒng)計難易中中易難2.針對SSR標記存在問題

進行SSR技術體系優(yōu)化

從DNA提取、PCR擴增、電泳檢測等環(huán)節(jié)對SSR技術進行了全面優(yōu)化，最終建立如下SSR標準實驗體系

DNA提取:單粒種子及其它組織均研究出快速提取法

改良的玉米單粒種子DNA提取法兩步法高通量快速提取葉片PCR擴增：由4h減少為2h普通電泳檢測：測序膠電泳，約需30－40min；快速銀染法，由1.5h減少為約20min毛細管電泳檢測：96道毛細管電泳結合五色熒光檢測系統(tǒng)。每檢測96*10=960個樣品，約需20minSSR技術體系優(yōu)化SSR標準操作流程毛細管電泳及五色熒光檢測－ABI3730XL2006年

國家區(qū)試

玉米品種

真實性及

一致性檢

測總結

五色熒光掃描結果3.確定一套核心引物DNA指紋分析方法的種類及發(fā)展特征譜帶法僅在固定的材料范圍內(nèi)有效，效率很低

引物組合法通過不同引物的有限組合，完全可以區(qū)分全部材料，但不同研究者的數(shù)據(jù)不易整合

核心引物組合法是引物組合法的擴展，不同實驗室通過使用固定的一套核心引物組合，其指紋圖譜可以相互比較和整合，為玉米DNA指紋圖譜分析的標準化奠定基礎

核心引物概念：是指多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復性等綜合特性好，可作為初步研究優(yōu)先選用的一套引物評估指標符合孟德爾遺傳規(guī)律染色體定位清楚引物相互獨立，沒有或很少連鎖擴增容易電泳分型結果準確，沒有異常電泳行為位點突變率足夠低同一個體不同器官組織的分型結果一致多態(tài)性足夠高具有種屬特異性具有復合擴增的潛力建庫用核心引物評估指標玉米核心引物篩選技術路線1900100網(wǎng)上和文獻上的多態(tài)性初篩500

800

實驗室用骨干自交系和常用雜交種復篩多態(tài)性和帶型分布的篩選擴增效果的評估和改進基于ABI3730XL的熒光復合擴增體系建立40考慮染色體分布的均勻性軟件評估實驗評估重新設計熒光加尾序列熒光多重PCR提高通量考慮擴增片段大小范圍降低費用1010基本核心引物擴展核心引物核心引物的確定1010建指紋庫4.通過多重PCR研究

提高建庫效率概念：在同一反應體系中同時進行多個位點的特異性擴增的一類特殊PCR反應類型，具有快速高效、成本低廉等優(yōu)點，適應高通量DNA指紋分析的需要引物選擇與分組原則：每種引物在選定的退火溫度作單一PCR時能得到有效擴增同一組合的引物擴增片段大小的范圍不能重疊盡量避免同一組合的引物序列形成引物寡聚體及引起競爭性擴增發(fā)展：五色熒光技術的應用，可以在PCR反應中對不同組合的引物標記不同的熒光，從而使得多重PCR同時擴增的引物位點數(shù)目可增加到10個以上多重PCR的概念及分組原則多重PCR試驗結果5.制作玉米DNA指紋純度及

真?zhèn)螜z測復合擴增試劑盒多色熒光相結合多重PCR與6.制定一套DNA

指紋標準化實驗規(guī)程標準化是DNA指紋庫建立及應用于品種鑒定實踐的前提和基礎DNA指紋庫能否應用的關鍵是不同實驗室對同一樣本測試的基因型必須完全一致，數(shù)據(jù)具有可比性人類DNA指紋庫構建情況美國CODIS系統(tǒng)：13個STR標記英國：6個STR標記歐洲：7個STR標記我國玉米DNA指紋庫構建承擔農(nóng)業(yè)部國家區(qū)試玉米DNA指紋鑒定方法標準及管理辦法制定承擔農(nóng)業(yè)部品種權保護玉米DNA指紋鑒定方法標準制定參與國際UPOV的關于“分子標記選擇與指紋庫構建”的BMT指南的修訂已制定的DNA指紋相關檢測標準7.利用雜交種果皮DNA獲取

母本父本自交系指紋基本原理玉米子粒的果皮是由子房臂和珠被細胞發(fā)育而來的，其基因信息完全繼承母本，沒有父本的基因成分在不提供親本的情況下，只要有純度較高的雜交種種子，分離提取其果皮DNA，擴增得到的果皮DNA指紋能完全代替母本指紋，作為母本自交系保護的依據(jù)由于采用的SSR標記是共顯性標記，在得到雜交種和母本DNA指紋后，可推測出父本DNA指紋，也可為父本自交系保護提供依據(jù)8.確定是否冒用他人

－親子鑒定為確定待檢玉米雜交種是否冒用了他人某一自交系，可對雜交種和爭議親本自交系進行親子鑒定，明確二者的親子關系親權指數(shù)PI=X/Y＝1/p（指爭議親本為雜交種親本的可能性是隨機親本為雜交種親本可能性的多少倍；p為基因型頻率）相對親權概率RCP=PI/(1+PI)=1/(1+p)累積RCP=∏PI/(1+∏PI)鑒定標準：認定標準：PI>2000;RCP>99.99%排除標準：2個以上位點不符合孟德爾遺傳9.依賴性派生品種鑒定派生品種概念：UPOV公約1991年文本中首次提出需同時具備以下三個特征：從原始品種依賴性派生，同時又保留表達由原始品種基因型或基因型組合產(chǎn)生的基本特性與原始品種有明顯區(qū)別除派生引起的性狀有差異外，在表達由原始品種基因型或基因型組合產(chǎn)生的基本特征特性方面與原始品種相同天然突變或誘變、體細胞無性變異、從原始品種中連續(xù)回交、遺傳轉化、轉基因等

10.確定品種DNA指紋鑒定標準20個基本核心引物不同品種不同品種相近品種20個擴展核心引物直接田間成對比較≥2locidiff≥2locidiffnolocidiff1locidiff近似品種相同或極近似品種IfneededIfneeded1locidiffnolocidiff疑同品種真實性判定標準采用農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準《國家玉米區(qū)試品種一致性及真實性DNA指紋檢測技術》先用20對基本核心引物檢測，獲得所測品種在20個引物位點的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)，利用20個位點的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)進行品種間比較：a)品種間差異位點數(shù)≥2，判定為不同品種；b)品種間差異位點數(shù)＝1，判定為高度相近；c)品種間差異位點數(shù)＝0，判定為疑同品種。對b)和c)的情況，繼續(xù)用20對擴展核心引物進行檢測，利用40個位點的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)進行品種間比較：品種間差異位點數(shù)≥2，判定為不同品種；品種間差異位點數(shù)＝1，判定為高度近似；視為相同。品種間差異位點數(shù)＝0，判定為相同品種或極近似品種。一致性分級標準一致性分級分級標準1級（好）(i)R≧99%；或(ii)所有10個位點一致性均為高2級（較好）95%≦R＜99%，且一致性差的位點數(shù)為≦23級（中）(i)95%≦R＜99%,且一致性差的位點數(shù)≧3個；或(ii)90%≦R＜95%，且一致性差的位點數(shù)為≦4個；或(iii)85%＜R＜90%，且一致性差的位點數(shù)為≦2個4級（較差）(i)85%＜R＜90%,且一致性差的位點數(shù)為3-4個；或(ii)90%≦R＜95%；且一致性差的位點數(shù)≧5。5級（差）(i)R≦85％；或(ii)85%＜R＜90%，且一致性差的位點數(shù)≧5參考指標：單個引物位點的一致性r：一致性差（r≦85％）、中（85％＜r＜95%）、高（r≧95％）

所有引物位點的平均一致性比率R：一致性差（R≦85％）、中（85%＜R＜95%、高（R≧95％）DNA指紋檢測方法標準審定會－2005.11UPOV的BMT會議--分子測試指南草案修訂-2005.611.構建中國玉米品種標準DNA指紋庫代表性開放性結果準確、可靠、穩(wěn)定；技術簡便、經(jīng)濟、實用標準化與形態(tài)性狀數(shù)據(jù)庫相整合快速方便的查詢系統(tǒng)應用領域廣泛玉米DNA指紋庫所具備特性中國玉米品種DNA指紋數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)功能信息品種查詢標準圖譜繪制親子鑒定DNA指紋電泳圖片DNA指紋數(shù)據(jù)庫圖片庫形態(tài)性狀數(shù)據(jù)庫植株形態(tài)特征圖片整合品種基本信息分子標記基本信息純度鑒定一致性鑒定形態(tài)性狀基本信息數(shù)據(jù)庫品種查詢界面品種比較界面親子查詢－三