non-coding RNA-現(xiàn)代分子生物學(xué)課程ppt

NoncodingRNA海南大學(xué)園藝園林學(xué)院RNA的研究進(jìn)展RNA組學(xué)：通過對RNA的研究所取得的巨大成果而形成了RNA組。RNA研究已有百余年的歷史，其間有兩個(gè)階段時(shí)期。第一個(gè)階段：20世紀(jì)的50～60年代，各種RNA開始被發(fā)現(xiàn)，但對RNA的認(rèn)識(shí)還不深入。第二個(gè)階段：20世紀(jì)的80年代，RNA的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究表明RNA在遺傳方面的重要作用。Non-codingRNA（非編碼RNA）非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多種已知功能的RNA，還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點(diǎn)是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物學(xué)功能了。分類非編碼RNA從長度上來劃分可以分為3類：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等等；大于500nt，包括長的mRNA-like的非編碼RNA，長的不帶polyA尾巴的非編碼RNA等等。根據(jù)亞細(xì)胞定位可將非編碼RNA分為：細(xì)胞核非編碼RNA與細(xì)胞質(zhì)非編碼RNA。根據(jù)是否具有polyA尾結(jié)構(gòu)可將非編碼RNA分為具有polyA尾的非編碼RNA(polyA-plusncRNAs)和不具有polyA尾的非編碼RNA(polyA-minusncRNAs。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的長度可將非編碼RNA分為小非編碼RNA和長鏈非編碼RNA。分類根據(jù)生物學(xué)功能可將非編碼RNA分為：持家非編碼RNA和調(diào)控性非編碼RNA。持家非編碼RNA主要包括核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、引導(dǎo)RNA(gRNA)和端粒酶RNA;調(diào)控性非編碼RNA主要包括小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、與Piwi蛋白相互作用的piRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNAs)。分類調(diào)控非編碼RNA：長鏈非編碼RNA（lncRNA）短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）

非編碼RNA看家非編碼RNA調(diào)控非編碼RNA長鏈非編碼RNA（lncRNA）長鏈非編碼RNA通常是指長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。該概念是在2002年由日本科學(xué)家首次提出,他們在小鼠全長cDNA文庫的大規(guī)模測序中,鑒定了大量較長的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）它們的轉(zhuǎn)錄本序列都比較短，不超過40nt短鏈非編碼RNA分子雖小，卻參與了包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞代謝以及機(jī)體免疫在內(nèi)的幾乎所有生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)和控制，在生命體內(nèi)扮演著至關(guān)重要的角色。長鏈非編碼RNA（lncRNA）lncRNA不參與或很少參與蛋白編碼功能,位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)。近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程，其調(diào)控作用正在被越來越多的人研究。1.編碼蛋白的基因上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)；3.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位；8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。RNA

(small

noncoding

RNA)miRNA(microRNA)siRNA

(small

interfering

RNA)piRNA(piwi-interacting

RNA)esiRNA

(endogenous

siRNA)siRNAsiRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNA，它的長度一般為21~25nt。它在RNA干擾途徑中通過引導(dǎo)目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表達(dá)。siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果，這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項(xiàng)重要工具。也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。miRNA概念：miRNA是長約21～25nt的單鏈RNA,其中50%定位于易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的染色體區(qū)域。特點(diǎn)：miRNA是內(nèi)源性的,是生物體基因的表達(dá)產(chǎn)物;miRNA是由不完整的發(fā)卡狀雙鏈RNA,經(jīng)Drosha和Dicer酶加工而成。piRNApiRNA是近年來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約為24～31nt的RNA分子,因在生理狀態(tài)下能與piwi蛋白偶聯(lián),故命名piRNA。由于Piwi為一表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子,能與PcG蛋白共同結(jié)合于基因組PcG應(yīng)答元件上,協(xié)助PcG沉默同源異型基因,因此推測與Piwi相關(guān)的piRNA也應(yīng)具有表觀遺傳學(xué)的調(diào)控作用

piRNA的形成及擴(kuò)增piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，能在u位點(diǎn)進(jìn)行切割形成piRNA反義鏈，piRNA反義鏈能與轉(zhuǎn)座子識(shí)別，并使切割后的轉(zhuǎn)座子與AGO3蛋白結(jié)合，從而進(jìn)一步對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行修飾切割，切割后的轉(zhuǎn)座子可以與piRNA前體結(jié)合，并且在U位點(diǎn)切割前體，從而使切割后的前體與piwi蛋白結(jié)合，進(jìn)過剪切修飾形成PiRNA和PiRNA與Piwi蛋白結(jié)合的復(fù)合體，從而使PiRNA數(shù)量增多。非編碼RNA的比較非編碼RNA的作用

1.影響染色體的結(jié)構(gòu)

2.調(diào)控轉(zhuǎn)錄

3.參與RNA的加工、修飾

4.參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯調(diào)控過程

5.影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)

6.在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中的調(diào)控作用

7.在細(xì)胞發(fā)育和分化中的調(diào)控作用非編碼RNA的檢測技術(shù)cDNA克隆策略實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR技術(shù)）SAGE技術(shù)微陣列芯片檢測技術(shù)Solexa測序法表面增強(qiáng)拉曼光譜法cDNA克隆策略長度在20～500bp的RNA大多為非編碼RNA。非編碼RNA可將由變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離到的非編碼RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后加上接頭，并克隆到標(biāo)準(zhǔn)載體中構(gòu)建cDNA文庫。為防止5'端丟失常在3′端加上C-尾巴，在T4RNA連接酶的作用下連上寡聚核苷酸接頭，最后對連接產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。cDNA克隆策略可鑒別已知的高豐度非編碼RNA，如tRNAs或小核糖體RNA。實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR技術(shù)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種高通量、靈敏的基因表達(dá)檢測技術(shù)，常用于蛋白編碼基因表達(dá)檢測，也被廣泛地應(yīng)用于microRNA或其他非編碼RNA的表達(dá)檢測。通過該技術(shù)，可定量監(jiān)測目的基因的表達(dá)情況，篩選生物學(xué)功能相關(guān)的非編碼RNA。SAGE技術(shù)SAGE是一種高通量的研究技術(shù)，通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,從而獲得SAGE雙標(biāo)簽,然后,通過連接、擴(kuò)增雙標(biāo)簽片段并進(jìn)行克隆、測序，以同一標(biāo)簽在某組織中出現(xiàn)的頻率，反映該標(biāo)簽所代表的基因在該組織中的表達(dá)豐度。與微陣列芯片技術(shù)相比，SAGE可在未知任何基因或EST序列的情況下，對靶細(xì)胞進(jìn)行研究，具有顯著的優(yōu)越性。微陣列芯片檢測技術(shù)微陣列芯片以高密度陣列為特征，在微陣列上固定大量探針分子，并將標(biāo)記樣本與微陣列探針進(jìn)行雜交。通過檢測雜交信號的強(qiáng)度，研究不同樣本中特異基因的表達(dá)豐度，從而較為全面地比較不同樣本中基因表達(dá)水平的差異。被廣泛用于mRNA的研究，也被用于非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)與表達(dá)分析。Solexa測序法Solexa測序法是新發(fā)明并迅速得到廣泛應(yīng)用的一種高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)，該方法是利用單分子陣列來測定基因的表達(dá)情況。首先，將核酸從細(xì)胞中提取，將其片段化為100～200堿基大小，分別連上接頭，經(jīng)接頭引物的PCR擴(kuò)增后制成文庫；然后，將已加入接頭的核酸片段固定在含有接頭的芯片上，經(jīng)反應(yīng)后，將不同片段擴(kuò)增。在每個(gè)循環(huán)中，利用邊合成邊測序的原理，在單分子陣列中加入4種熒光標(biāo)記染料的核苷和聚合酶，在酶的作用下，每個(gè)單鏈DNA分子通過互補(bǔ)堿基的配對被延伸，通過CCD采集熒光信號，快速掃描整個(gè)陣列，檢測特定的結(jié)合在每個(gè)片段上的堿基，從而進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄本的測序。盡管Solexa測序技術(shù)以高效率、高精確鑒定miRNA著稱，但相對于傳統(tǒng)、普遍使用的miRNA定量方法還存在一定的不足，這可能是由于測序深度不足，或一些microRNA存在特殊修飾而帶來的問題。表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS）利用水的拉曼散射很微弱這一特點(diǎn)，高靈敏度和特異性的SERS檢測技術(shù)逐漸成為研究水相中的生物和化學(xué)樣品的理想工具，應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、蛋白和核酸等生物樣品的檢測?？寺》蔷幋aRNA的方法基因克隆法蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物分離法基因克隆法小鼠腦→組織勻漿→提取總RNA→8%PAGE回收50-110nt（fractionalⅠ）和110-500nt（fractional）→Poly(A)聚合酶加尾→cDNApSPORTI→PCR→高密度陳列→雜交除去高豐度已知的小RNA→未雜交的cDNA測序。蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物分離法分離蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)，純化RNA分子，反轉(zhuǎn)錄cDNA，克隆、測序、結(jié)果分析。所得RNA的cDNA分子必須進(jìn)行Northern雜交，除去斷裂的小RNA。microRNA2001年命名為microRNA2002年入選為science年度十大發(fā)現(xiàn)之首MicroRNAmicroRNA（簡稱miRNA）是一種非編碼小RNA分子（約含22個(gè)核苷酸，19~25）存在于植物，動(dòng)物和一些病毒中，其功能在RNA沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA的特點(diǎn)單鏈RNA19~25nt，非編碼RNA單一的目標(biāo)miRNA可能靶向數(shù)百個(gè)基因抑制翻譯（動(dòng)物）或降解靶RNA（植物）對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、癌變及病毒感染起調(diào)控作用保守性進(jìn)化3.miRNA的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)2.miRNA的作用機(jī)理1.miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)3.miRNA的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)2.miRNA的作用機(jī)理1.miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)第一節(jié)miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)

miRNA的產(chǎn)生：植物miRNA的形成包括miRNA基因轉(zhuǎn)錄、加工成熟和功能復(fù)合體組配三個(gè)過程。miRNA基因轉(zhuǎn)錄：通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中形成初級轉(zhuǎn)錄本，稱為primarymiRNAs（pri-miRNAs）。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸開頭，具有5'帽子和3'-polyA尾，位于一個(gè)保守的TATA-box序列的下游40個(gè)核苷酸序列處。第一節(jié)miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)

加工成熟：植物miRNA的加工成熟過程是由存在細(xì)胞核內(nèi)的Dicer酶類似物，在HYL1蛋白的協(xié)助下，以一種ATP依賴的方式，通過兩次剪切步驟生成。第一次剪切pri-miRNA后，產(chǎn)生具有莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，接著在兩個(gè)蛋白酶HYL1和SERRATE的協(xié)助下再次切割pre-miRNA，將miRNA/miRNA*二聚體從pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的“莖”上剪切下來。miRNA基因在細(xì)胞核中經(jīng)由RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、DCL1剪切后和HEN1介導(dǎo)的甲基化后，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HASTY（HST）從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。第一節(jié)miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn)功能復(fù)合體組配：miRNA/miRNA*二聚體中miRNA鏈在SDN的誘導(dǎo)下裝載進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），成熟miRNA與ARGONAUTE1（AGO1）蛋白結(jié)合，形成非對稱的RISC，而miRNA*則被降解。miRNA引導(dǎo)RISC切割目標(biāo)靶基因mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)功能。micorRNA的產(chǎn)生micorRNA的產(chǎn)生micorRNA的產(chǎn)生

micorRNA的產(chǎn)生RISC：RNA-InducedSilencingComplex一種多結(jié)構(gòu)域的雙鏈RNA專一性RNaseⅢmiRNA如何行使功能？與mRNA的3‘端非編碼區(qū)特定位點(diǎn)(其第2~8個(gè)核苷酸)綁定：>與mRNA完美互補(bǔ)時(shí)——會(huì)引發(fā)mRNA降解；>不完美的與mRNA配對時(shí)，會(huì)引發(fā)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（抑制靶基因的表達(dá)）從而抑制或阻止相應(yīng)的mRNA翻譯過程。舉例分析：在DNA修復(fù)通路中行使上述過程1）抑制或阻止正常細(xì)胞DNA修復(fù)產(chǎn)生致癌作用2）抑制或阻止癌細(xì)胞DNA修復(fù)達(dá)到治療效果植物miRNA的特點(diǎn)植物miRNA與動(dòng)物miRNA的相類似特點(diǎn)(1)miRNA廣泛存在于真核生物中。(2)miRNA的長度約為20～24nt。(3)miRNA沒有開放閱讀框(ORF)及蛋白質(zhì)編碼基因特點(diǎn)。(4)miRNA的基因成簇性。(5)miRNA的保守性。植物miRNA的特點(diǎn)植物miRNA與動(dòng)物miRNA的相類似特點(diǎn)(6)miRNA表達(dá)的時(shí)空特異性。(7)幾乎所有的miRNA從前體的1條臂中加工而來。(8)miRNA的5端多以U開頭。植物miRNA的特點(diǎn)植物miRNA與動(dòng)物miRNA的不同特點(diǎn)(1)植物miRNA前體的大小變化較大，一般為64～303nt，而動(dòng)物miRNA前體的變化較小，一般為60～75nt。(2)植物中的miRNA較動(dòng)物中的更為保守，它們與互補(bǔ)序列的錯(cuò)配數(shù)也少于動(dòng)物。植物miRNA的形成miRNA成熟所需的酶類一種多結(jié)構(gòu)域的雙鏈RNA專一性RNase1II(Dicer酶、類Dicer酶)和Argonaute蛋白。Dicer酶包含4種結(jié)構(gòu)域：RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ(Piwi—ArgonauteZwille)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)Argonaute蛋白具有PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域。植物miRNA的作用機(jī)制miRNA的作用方式可根據(jù)其與靶基因的互補(bǔ)程度不同而分為兩種：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物裂解和翻譯抑制。a.當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)或接近完全互補(bǔ)時(shí)，則會(huì)切割mRNA；b.當(dāng)植物miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，則抑制其翻譯。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也可以通過目標(biāo)染色體位點(diǎn)的甲基化，或通過調(diào)控靶mRNA的定位或穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用。植物miRNA的功能1抗生物脅迫植物中存在一類miRNA與多種植物病毒基因完全或不完全互補(bǔ)，推測這類miRNA可通過切割病毒基因抑制病毒侵染。2抗非生物脅迫2．1抗?fàn)I養(yǎng)脅迫(1)調(diào)節(jié)植物磷代謝平衡Chiou發(fā)現(xiàn)，在磷脅迫下，擬南芥中miR399大量表達(dá)；而在高磷條件下，未檢測到miR399的表達(dá)。(2)調(diào)節(jié)植物硫代謝平衡miR395在高硫條件下不表達(dá)，在硫缺失脅迫下表達(dá)。植物miRNA的功能2抗非生物脅迫2．2抗環(huán)境脅迫miRNA可以使植物抵抗寒冷、高濃度ABA、干旱、高鹽等極端自然環(huán)境及抵抗環(huán)境引起的自身氧化脅迫。miRNA的檢測miRNA的獲取miRNA的確認(rèn)miRNA的檢測方法miRNA的獲取miRNA分子的序列短小1）在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列2）在不同生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不盡相同3）通常與多種蛋白相互作用這使得建立一個(gè)有效而且普遍適用的研究方法異常困難。#到目前為止,miRBase上公布的miRNA總數(shù)將近3000種。#現(xiàn)在已知靶基因的miRNA多是通過基因克隆和生物信息學(xué)篩選的方法發(fā)現(xiàn)的。miRNA的獲取——基因克隆1.1基因克隆直接克隆的方法通常是從總RNA中提取大約22nt的小RNA分子,制備一個(gè)小RNA的cDNA(complementaryDNA)文庫。將文庫中的小RNA序列與基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST序列類似性比對,排除非miRNA序列后,通過Northern印跡方法(Northernblotting)得到最終確認(rèn)。目前大量的已知miRNA都是通過這種方法獲得的?；蚩寺》椒ǖ膬?yōu)點(diǎn)是對于高豐度或常表達(dá)的基因來說,可以獲得完整的miRNA序列。然而對于另一些miRNA,它們在生物體內(nèi)濃度很低(表達(dá)量低或表達(dá)產(chǎn)物極不穩(wěn)定,或前體到成熟的加工效率低等原因引起),或者某些只在生物體的特定時(shí)期或特定組織器官中表達(dá),直接克隆法則無法獲取。注：Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。miRNA的獲取——生物信息學(xué)篩選1.2生物信息學(xué)篩選隨著生物全基因組測序的完成,利用計(jì)算機(jī)對基因組序列進(jìn)行搜索可以大大提高miRNA的鑒定效率。所以,人們根據(jù)目前已知的miRNA基因序列總結(jié)它們的特征和規(guī)律,編寫了一些計(jì)算機(jī)程序,通過對生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,可以找到那些可能為miRNA的基因序列,然后通過Northernblotting來篩選真正的miRNA基因。

生物信息學(xué)方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的miRNA具有較大的序列同源性以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索新的miRNA基因。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理并結(jié)合生物信息軟件在已測序基因組中進(jìn)行搜索比對，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數(shù)量。近年來隨著miRNA預(yù)測方法的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量呈幾何級數(shù)增長。這些預(yù)測方法從簡單的序列比對搜索發(fā)展到現(xiàn)在的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，程序設(shè)計(jì)越來越智能化，復(fù)雜化。miRNA的獲取——生物信息學(xué)篩選隨著人miRNA基因轉(zhuǎn)錄出的pri-miRNA迅速加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，隨后被切割成miRNA：miRNA*雙體，并被選擇性地組合進(jìn)核糖核酸沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（RISC）并進(jìn)行靶基因識(shí)別。在相似的物種中，miRNA是很保守的；但在相距較遠(yuǎn)的物種間，miRNA又有一定的分歧，尤其體現(xiàn)在pre-miRNA上。這些miRNA功能作用機(jī)制的闡明為預(yù)測軟件的研發(fā)提供了理論依據(jù)，但仍需要不斷修補(bǔ)和完善。近年來，幾個(gè)基于這些規(guī)則的miRNA預(yù)測程序先后被開發(fā)（下表），并被廣泛使用。生物信息學(xué)手段可以說是一種更高通量的方法。通常有以下幾種方法:①M(fèi)irscan是一種基于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,通過掃描兩種系之間是否存在同源的莖環(huán)結(jié)構(gòu),應(yīng)用于檢測脊椎動(dòng)物和線蟲的候選基因。miRNA的獲取——生物信息學(xué)篩選②Mirseeker是一種檢查RNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,應(yīng)用于篩選昆蟲的候選基因。它是根據(jù)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測的:一是具有長度為70～100nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Pre-miRNA;二是不同種系生物中Pre-miRNA的保守性;三是miRNA的核苷酸差異性。③ERPIN是一種類似于BLAST的校對程序,用于搜尋動(dòng)物基因組中與miRNA序列類似的序列。④MiPred可以通過randomforest預(yù)測模型和miRNA特征的結(jié)合,區(qū)分miRNA的真正前體和假冒前體。miRBase序列數(shù)據(jù)庫miRBase序列數(shù)據(jù)庫是一個(gè)提供包括miRNA序列數(shù)據(jù)、注釋、預(yù)測基因靶標(biāo)等信息的全方位數(shù)據(jù)庫，是存儲(chǔ)miRNA信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一。miRBase提供便捷的網(wǎng)上查詢服務(wù)，允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA和靶標(biāo)信息，詳情請（/）。2012年8月1日正式發(fā)布。相比于以往版本的數(shù)據(jù)庫（SangermicroRNA序列數(shù)據(jù)庫），19.0版數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了巨大的數(shù)據(jù)更新：miRNA發(fā)夾前體序列已升至21264條，新增3171條；成熟miRNA升至25141條，新增3625條；已發(fā)布的miRNA序列共涵蓋193個(gè)物種，相比于18.0版新增25個(gè)物種。新版數(shù)據(jù)庫對miRNA序列注釋和命名進(jìn)行了系統(tǒng)的修正，miR*命名已經(jīng)終止使用，取而代之的是-5p和-3p的命名法。miRNA的確認(rèn)判斷標(biāo)準(zhǔn):①能夠通過與特定大小的總RNA樣品雜交得到22個(gè)堿基對(～22nt)的產(chǎn)物(即需要Northern雜交或引物延伸反應(yīng)驗(yàn)證表達(dá))。②所得的序列是從特定大小的(～22nt)的小分子RNA庫中克隆到的,并且必需與克隆的來源物種的基因組序列完全匹配。③經(jīng)過前體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,有發(fā)夾狀的二級結(jié)構(gòu),并且成熟的miRNA序列在發(fā)夾的一條臂上。④成熟的miRNA序列與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)在不同物種間有保守性。⑤在Dicer突變的系統(tǒng)中,前體的積累增多。要確認(rèn)基因克隆獲得的或生物信息學(xué)分析預(yù)測的基因是否為真正的miRNA,就應(yīng)該采用上面5個(gè)原則來檢驗(yàn)。miRNA的檢測方法要了解miRNA在基因調(diào)控中扮演的角色,很關(guān)鍵的一個(gè)方法就是迅速、準(zhǔn)確地定量檢測miRNA基因的表達(dá)。檢測miRNA的方法主要有以下幾種:①Northernblotting是現(xiàn)在檢測miRNA表達(dá)最主要的手段,所有克隆和生物信息學(xué)分析得來的miRNA都需要經(jīng)過Northernblotting來驗(yàn)證和確認(rèn)。這種方法的缺點(diǎn)在于靈敏度較低且不能進(jìn)行高通量的檢測。miRNA的檢測方法②RT-PCR（reversetranscriptionPCR，反轉(zhuǎn)錄PCR）也被用來檢測miRNA前體的表達(dá)水平,但miRNA前體的表達(dá)水平并不一定和成熟miRNA的表達(dá)水平一致。因此,在RT-PCR的基礎(chǔ)上,人們改進(jìn)了一些技術(shù),從而使得能夠檢測低表達(dá)量的miRNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)可以很精確的定量分析miRNA的表達(dá),也經(jīng)常用于驗(yàn)證預(yù)測的miRNA。引物延伸法,就是在引物的5′末端加一個(gè)特異標(biāo)記,可以定量測定低豐度的RNA含量。原位雜交技術(shù),可以方便的檢測miRNA的時(shí)空表達(dá)的差異。原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。另有熒光原位雜交。miRNA的檢測方法③芯片技術(shù)(mi-croarray)是一種更快、更廣泛、更有前途的研究miRNA表達(dá)的方法。Liu等最先發(fā)表了關(guān)于微點(diǎn)陣能夠獲得高通量的結(jié)果。這些結(jié)果顯示了組織特異性miRNA的表達(dá)標(biāo)記,而且通過Northernblot和real-timePCR進(jìn)行了驗(yàn)證。芯片技術(shù)固然以其高通量和并行處理的特點(diǎn)在基因信息分析中占據(jù)重要地位,但信息量大并不等于質(zhì)量高。實(shí)際上,基因芯片的一個(gè)突出弱點(diǎn)就是其信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性比較差,且無法實(shí)現(xiàn)定量檢測,因此后來又出現(xiàn)了多種改進(jìn)的芯片技術(shù),其中現(xiàn)在流行的就是液相芯片技術(shù)。液相芯片(liquichip)是美國納斯達(dá)克上市的Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù),它既能為后基因組時(shí)代科學(xué)研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支持,又能提供高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺(tái)。miRNA的識(shí)別多個(gè)研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得