分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(核酸的分子雜交)

第五節(jié)核酸的分子雜交

NucleicAcidHybridizationContentofTable

前言1核酸分子雜交技術(shù)的原理2核酸探針的制備3核酸探針的標(biāo)記4核酸分子雜交技術(shù)5生物芯片技術(shù)

前言核酸分子雜交

把親源關(guān)系較近的，不同生物個體來源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。Home1核酸分子雜交技術(shù)的原理有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應(yīng)同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe),與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進(jìn)行雜交。再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。

應(yīng)用：(1)檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。Home2核酸探針的制備2.1探針（Probe)的概念:

一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。2.2探針的制備方法長度一般以50~300bp為宜。制備方法：

(1)DNA重組技術(shù)(2)PCR擴(kuò)增(3)化學(xué)合成2.3探針的分類

據(jù)來源及性質(zhì)不同可分為：

(1)基因組DNA探針(2)cDNA探針(3)RNA探針(4)寡核苷酸探針2.4合成寡核苷酸探針注意原則(1)長度（10-50bp);(2)G:C對含量40%-60%；(3)探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4)避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列相同，最好不用。Home3核酸探針的標(biāo)記為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。3.1標(biāo)記的種類同位素：32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針非同位素：生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物

兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時間較長，無同位素污染。一個理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：(1)標(biāo)記前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡單、節(jié)時；(4)安全、無環(huán)境污染。3.2探針的標(biāo)記方法3.2.1缺口平移法3.2.2隨機(jī)引物標(biāo)記法3.2.3末端標(biāo)記法3.2.4生物素光照標(biāo)記法Home缺口平移法的原理將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相結(jié)合。首先用E.coli的DNAseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。

這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。

隨機(jī)引物標(biāo)記法原理用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對原則不斷在其3`-OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。末端標(biāo)記法原理（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個單標(biāo)記的[α-32P]dNTP。生物素光照標(biāo)記法光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。4核酸分子雜交技術(shù)此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。4.1Southern印跡雜交帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜。真空轉(zhuǎn)膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉(zhuǎn)膜4.2Northern印跡雜交

與Southern雜交類似。檢測目的RNA的存在與否及含量。4.3Western印跡雜交將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。4.4斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印