基因工程復(fù)習(xí)題

顯性質(zhì)?！獙λ拗骷?xì)胞產(chǎn)生新的遺傳表型的質(zhì)粒；例如：抗抗生素的抗性質(zhì)粒（R質(zhì)粒），產(chǎn)生大腸桿菌素(colicins)的Col質(zhì)粒、引起細(xì)菌接合性的育性質(zhì)粒（F質(zhì)粒）和致植物形成冠癭瘤的Ti質(zhì)粒等。隱型質(zhì)?！獙λ拗骷?xì)胞不產(chǎn)生任何新遺傳性狀的質(zhì)粒。

天然DNA的來源和用途染色體DNA：染色體DNA是分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的主要材料，也可提供構(gòu)建染色體和染色體基因整合平臺系統(tǒng)之用；病毒DNA：病毒DNA主要用于構(gòu)建基因克隆載體，也能作為分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的材料；質(zhì)粒DNA：質(zhì)粒DNA主要用于構(gòu)建克隆載體，也能作為分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的材料；線粒體和葉綠體DNA：線粒體和葉綠體DNA主要作為分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子的材料，也能用于構(gòu)建克隆載體。質(zhì)粒（plasmid）—細(xì)菌或細(xì)胞染色體以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的小型共價閉合雙鏈環(huán)狀DNA，對細(xì)菌的某些代謝活動和抗藥性的表型有一定的作用。標(biāo)記基因：是一種已知功能或已知序列的基因，能夠起著特異性標(biāo)記的作用，它是對目的基因進(jìn)行標(biāo)記的工具。4.斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交

斑點(diǎn)印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。PCR技術(shù)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱基因的體外擴(kuò)增法，是通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶：識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈，主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵相容性末端：雖然不同種的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA雙鏈末端在大多數(shù)情況下是不同的，但有些不同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端卻是相同的，即具有相同類型的突出末端（都是5`端或3`端突出），突出的核苷酸數(shù)目相等且序列也相同，因而可以互相連接起來。這種由不同種限制酶產(chǎn)生的能相互連接的末端常稱之為相容性末端。這種酶則稱之為同尾酶。部分酶切：指選用的限制酶對在DNA分子上的全部識別序列進(jìn)行不完全的切割。主要用于構(gòu)建基因組文庫，在目的基因序列中存在該酶的識別序列時，通過部分酶切方法可以得到完整的目的基因片段。TA克隆載體：用Taq酶的PCR產(chǎn)物3’端加上了一個A。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出一種線性質(zhì)粒，其5’端突出的T，它們之間可以連接，即TA克隆。表達(dá)載體：是指具有宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體?；蚪M文庫：生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌中的群體之中，這個群體極為該生物的基因組文庫?；蚩寺。航?jīng)無性繁殖獲得基因許多相同拷貝的過程。通常是將單個基因?qū)胨拗骷?xì)胞中復(fù)制而成。目的基因：優(yōu)良性狀相關(guān)的基因，即用于克隆的基因。RT-PCR：屬于定量PCR的一種，以一定時間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。受體細(xì)胞：能夠接受外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞，也指具有應(yīng)用理論研究的細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞：細(xì)菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)。這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。外植體：用于基因轉(zhuǎn)化的植物受體部分通常稱為外植體?；蚬こ趟幬铮夯蚬こ趟幬锸窍却_定對末疾病有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成過程的基因取出來，經(jīng)過一些列的基因操作，最后將該基因放入可大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中去，在受體細(xì)胞中不斷繁殖過程中，大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這些疾病的蛋白質(zhì)，即基因疫苗和藥物。核酸疫苗：又稱DNA疫苗是一種攜帶外源基因的表達(dá)載體，這種外源基因編碼某種病毒或病原菌的抗原蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因動物：將外源重組基因轉(zhuǎn)移并整合到動物受體細(xì)胞基因組中，從而形成在體內(nèi)表達(dá)外源基因的動物。基因治療：基因治療是指以正常的基因替代或修補(bǔ)病人細(xì)胞缺陷基因，從而達(dá)到治療疾病的目的它是治療分子疾病最有效的手段之一。表達(dá)系統(tǒng)：外源基因表達(dá)系統(tǒng)泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)目的基因產(chǎn)物。包涵體蛋白：在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)。星活性：限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能切割與之特異性識別順序類似的序列，降低酶切的特異性，這種現(xiàn)象稱之為星活性。結(jié)構(gòu)基因：負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞代謝途徑中組成型蛋白質(zhì)的基因。其所編碼的蛋白質(zhì)一般不作為調(diào)節(jié)因子。CDNA文庫：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。啟動子：DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域，在許多情況下，還包括促進(jìn)這一過程的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。酶單位：一個國際通用酶單位指在25‘C、最適條件下，1min中內(nèi)能引起1umol底物發(fā)生的反應(yīng)量。以U表示。定量PCR：定量PCR技術(shù)有廣義和狹義概念。廣義概念的定量PCR是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的檢測，進(jìn)行PCR起始模板的定量。狹義概念的定量PCR技術(shù)是指用外標(biāo)法通過檢測PCR過程達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果。電穿孔轉(zhuǎn)化法：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA分子就可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?；驑尫ǎ夯驑尫ㄓ址Q微彈轟擊法，它是運(yùn)用高速運(yùn)行的金屬微粒轟擊細(xì)胞時能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象，將包裹在金屬微粒表面的外源DNA分子帶入細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化方法。基因工程研究的技術(shù)路線是什么？答：1.提取目的基因基因操作的第一步就是提取目的基因，即取得人們所需用的基因。提取目的基因主要有兩條途徑：一條是從供體細(xì)胞的DNA直接分離基因；另一條是人工合成基因。2.目的基因與載體結(jié)合將目的基因與載體結(jié)合的過程實(shí)際上是不同來源的DNA重新組合的過程。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞用人工的方法使體外重組的DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，主要是借鑒細(xì)菌或病毒浸染細(xì)胞的途徑。4.目的基因的檢測和表達(dá)在全部受體細(xì)胞中，真正能夠攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞是很少的。重組DNA分子進(jìn)入細(xì)胞后，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特地的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)過程。重組DNA的含義？答：在體外將目的基因片段插入載體上，構(gòu)建重組DNA，并使之進(jìn)入到原先沒有這類分子的受體細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的增值和表達(dá)的過程。為什么反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中會出錯？答：反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中出錯的原因:逆轉(zhuǎn)錄酶又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，以mRNA為模板合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄酶有5‘-3’的聚合酶活性，而缺少聚合酶中起校正作用的3‘-5’的外切核酸酶活性，發(fā)生突變而使聚合反應(yīng)出錯。天然DNA包括那些類型DNA？答：天然DNA包括：染色體DNA，病毒和噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA，線粒體和葉綠體DNANorthern印跡和Southern印跡的兩個根本的區(qū)別是什么？答：Northern印跡和Southern印跡兩者的主要區(qū)別：1.印跡轉(zhuǎn)移過程中轉(zhuǎn)移對象不同。Nothern轉(zhuǎn)移的是RNA，而Southern轉(zhuǎn)移的是DNA。2.電泳條件不同，前者是變性條件，后者是非變性條件5、用于核酸雜交的硝酸纖維素膜和尼龍等膜固相支持物具有哪些優(yōu)良特性?答：硝酸纖維素膜具有以下優(yōu)良特性：

1)100％純硝酸纖維素，不含醋酸纖維素，確保最佳的蛋白結(jié)合效果；

2)有0.2和0.45u兩種孔徑，分別針對不同大小的蛋白樣品；

3)不需要甲醇預(yù)潤濕。尼龍膜具有以下優(yōu)良特性：

1)可以耐受嚴(yán)謹(jǐn)處理，不會收縮，破碎或撕裂；

2)使用定位孔精確對齊；

3)使用尼龍lifttab，易于移除膜。嚴(yán)禁核酸雜交試驗(yàn)是如何控制的?答：雜交反應(yīng)的嚴(yán)緊程度有下面兩個因素所決定：溫度和鹽濃度。強(qiáng)的堿基對才能耐受高的溫度，而高的鹽濃度使弱的堿基對間的配對變得穩(wěn)定。因此，高度嚴(yán)緊的雜交在高溫和低鹽濃度下進(jìn)行，而低嚴(yán)緊型雜交在低溫和高鹽濃度下進(jìn)行。7、什么限制性內(nèi)切酶的星號活性?受哪些因素影響？答：限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能切割一些與之特異型識別順序類似的序列，降低酶切的特異性，這種現(xiàn)象稱為星號活性。

引起星號活性的因素有很多：甘油濃度高，酶過量，離子強(qiáng)度高，pH過高或者加入了有機(jī)溶劑，或者用其他2價陽離子如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+代替了Mg2+。8、Klenow酶在基因工程中有什么作用？答：（1）補(bǔ)平由核苷酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端；（2）DNA片段的同位素末端標(biāo)記；（3）cDNA第二鏈的合成；（4）雙脫氧末端終止法測定DNA序列?？寺≥d體應(yīng)具備特點(diǎn)？答：1.復(fù)制起點(diǎn)：因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2.

克隆位點(diǎn)：以供外源DNA插入。3.遺傳標(biāo)記基因：以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞4.安全性：不含有害基因，不會任意傳播其他宿主細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞。闡述減少質(zhì)粒和噬菌體載體上某種酶的識別位點(diǎn)的方法和原理?答：方法：將質(zhì)?；蚴删w進(jìn)行體內(nèi)或體外突變，使某些酶的識別位點(diǎn)中的某些堿基變化，從而減少酶的識別。原理：酶都有特異的識別序列，改變后就不能被識別。什么是質(zhì)粒的相容性？什么是不相容型？答：質(zhì)粒的相容性：兩個質(zhì)粒在同一宿主中能共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不相容性：兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。闡述Ti質(zhì)粒的4個功能區(qū)？答：A.T-DNA區(qū)：Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只是約25kb的片段，這個片段稱為T-DNA（transferDNA);T-DNA兩端各有25bp長的正向重復(fù)序列(LTS和RTS)。B.Vir區(qū)：定位在T-DNA區(qū)上游的一組基因，它們的表達(dá)產(chǎn)物激活T-DNA向細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，使植物引發(fā)腫瘤，與膿桿菌的致病性相關(guān)（virulence）。C.Con區(qū)：與膿桿菌之間的接合轉(zhuǎn)移，即含有tra基因。D.Ori區(qū)：該區(qū)的基因能控制Ti質(zhì)粒的自我DNA復(fù)制。什么是cDNA文庫？同基因組文庫有何差？答：同mRNA互補(bǔ)的DNA稱為cDNA。cDNA文庫是以某一生物的總mRNA為模板，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補(bǔ)的DNA，即第一鏈，破壞模板后，再以第一聯(lián)為模板合成第二鏈，得到的雙鏈DNA稱為cDNA。選用合適的載體，將合成的cDNA重組導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群稱為cDNA文庫。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNA文庫是不可能構(gòu)建的十分健全的，也就是說任何一個cDNA文庫都不可能包含某一生物全部編碼基因。差別：（1）基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因；（2）基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)節(jié)因子的影響；（3）基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)的基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而cDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。建立一個基因組文庫后，如何鑒定一個含有目的基因的克隆？答：帶有某一細(xì)菌基因的克隆通?？梢灾苯涌闯鰜恚?yàn)榛虮磉_(dá)引起了宿主細(xì)胞表型的可見變化。然而，真核生物的基因不都表達(dá)，則需要相應(yīng)的方法來找出帶有所需基因特定克隆。一個常用的方法是雜交：（1）從不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纖維素濾膜上，然后用NaOH使之變性。（2）探針必須能與所需的基因互補(bǔ)且被32P標(biāo)記。探針可以是來自另一不同生物體的相關(guān)的基因，或是依據(jù)與基因特異相關(guān)蛋白質(zhì)