血紅蛋白的提取分離DNA的粗提取與鑒定課件

DNA的粗提取與鑒定提取生物大分子的基本思路是，選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。提取DNA就是利用DNA與RNA、蛋白質、脂質等理化性質的差異去除雜蛋白。DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，因此可以選擇適當鹽濃度使DNA充分溶解，使雜質沉淀，或者相反以達到分離的目的。進一步分離DNA和蛋白質，可利用DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精的原理。DNA的粗提取與鑒定進一步分離DNA和蛋白質，可利用DNA不13.蛋白酶能水解蛋白質,但對DNA無影響；多數(shù)蛋白質不能忍受60~80℃

的高溫，而DNA在80℃以上才會變性。洗滌劑能瓦解細胞膜，但對DNA沒有影響。在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色。

4.DNA粗提取與鑒定，四個主要的實驗步驟：

步驟目的①實驗材料的選取——雞血細胞DNA豐富②破碎細胞獲取含DNA的濾液③去除濾液中的雜質純化DNA④DNA的析出與鑒定鑒定DNA5.選取實驗材料，原則上凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，為提高實驗的成功率要選用DNA含量相對較高的生物組織，如雞血細胞、洋蔥等。破碎動物細胞常用蒸餾水，用玻璃棒攪拌后收集濾液。破碎植物細胞需先用洗滌劑、食鹽，再進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集濾液。3.蛋白酶能水解蛋白質,但對DNA無影響；多數(shù)蛋白質不能忍26.破碎細胞后獲取的濾液可能含有核蛋白、RNA、多糖等雜質?？筛鶕?jù)DNA的不同性質除去這些雜質：方法原理操作NaCl溶液分離法酶解分離法高溫變性分離法DNA與蛋白質等雜質在不同濃度NaCl溶液中的溶解度不同2mol/LNaCl溶液溶解DNA0.14mol/LNaCl溶液析出DNA蛋白質酶分解蛋白質不影響DNA濾液中加嫩肉粉（木瓜蛋白酶

）10~15min蛋白質在60~80℃大多變性DNA80℃以上變性60~75℃保溫10~15min6.破碎細胞后獲取的濾液可能含有核蛋白、RNA、多糖等雜質37.進一步提純DNA并使其析出可用體積分數(shù)95%、冷卻的酒精，然后用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，濾紙吸去上面的水分，鑒定DNA用二苯胺試劑。對照組的操作是：2mol/L的NaCl溶液5ml,加入4ml二苯胺，沸水浴5min，冷卻后試管顏色：無色。8.注意：雞血中加3g檸檬酸鈉防止血液凝固；加洗滌劑后要輕緩柔和，否則容易產生大量泡沫；玻璃棒攪拌要輕緩以免加劇DNA分子斷裂，不能形成絮狀沉淀；二苯胺要現(xiàn)配先用，否則會影響鑒定效果；提取器具最好用塑料燒杯，因為DNA容易被玻璃器皿吸附。7.進一步提純DNA并使其析出可用體積分數(shù)95%、冷卻的酒精4血紅蛋白的提取分離DNA的粗提取與鑒定課件5血紅蛋白的提取和分離從細胞中提取蛋白質，首先要使細胞破碎，常用的方法有酶解法、超聲波法、研磨法。分離不同種類蛋白質的依據(jù)是蛋白質各種特性的差異，如分子的形態(tài)和大小，所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等。凝膠色譜法又叫分配色譜法。是根據(jù)相對分子量大小分離蛋白質的有效方法。構成凝膠球體的成分大多數(shù)是多糖類化合物，球體內部有許多貫穿的通道，小分子蛋白質因易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢，后從層析液中洗脫出來，大分子蛋白質無法進入凝膠內部，只在凝膠珠間隙移動，路程較短，所以首先洗脫出來。血紅蛋白的提取和分離從細胞中提取蛋白質，首先要使細胞破碎，常6血液血漿水分其他物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團2.

血液有哪些成分？

1.

用雞的紅細胞提取DNA，用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提?。蝗说募t細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血液血漿水分其他物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細7

二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程

可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。(1)紅細胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。②洗滌操作：

1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數(shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理8初次離心后的結果初次離心后的結果93次洗滌后的結果3次洗滌后的結果10(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

二、實驗操作(2)血紅蛋白的釋放：加11(4)透析：

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質。

二、實驗操作原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內。緩沖液能夠抵制外界酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變。它通常由1~2種緩沖劑制成，這樣可以在實驗條件下準確模擬生物體內天然環(huán)境。(4)透析：①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，12利用透析袋透析利用透析袋透析13透析過程動畫演示透析過程動畫演示14凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米15裝配好的凝膠柱注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。裝配好的凝膠柱注意：16（2）樣品加入與洗脫

①調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。（2）樣品加入與洗脫①調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱17樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠18收集得到的純化后的蛋白收集得到的純化后的蛋白194.凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程4.凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程20

蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS1.原理：聚丙稀酰胺凝膠電泳

SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—