i型膠原與脂肪干細(xì)胞的生物相容性研究

i型膠原與脂肪干細(xì)胞的生物相容性研究

脂肪干燥能促進(jìn)血液循環(huán)，具有多向分化潛力，對各種組織的損傷有良好的修復(fù)效果，而且易于消化。這是組織工程研究中的一個重要種子細(xì)胞之一。理想的種植材料應(yīng)具有良好的生物相容性,對細(xì)胞、組織等無毒性。不同材料對細(xì)胞的生長、分化和黏附均有不同的影響,因而種子細(xì)胞能否在支架材料上良好生長,并表達(dá)自身特異性功能是目前組織工程研究的一個熱點。本實驗首次用人脂肪干細(xì)胞與I型膠原支架材料進(jìn)行體外混合培養(yǎng),了解支架材料對細(xì)胞粘附、生長、增殖等功能的影響,以便尋找適宜的脂肪組織工程細(xì)胞載體,為進(jìn)一步的體內(nèi)實驗提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料和細(xì)胞培養(yǎng)板DMEM、特級胎牛血清由Gibco公司生產(chǎn);I型膠原酶、胰蛋白酶、I型膠原支架材料、四氮唑復(fù)合物(XTT),硫酸酚嗪甲酯和二甲基亞砜均購自Sigma,12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning。1.2方法1.2.1細(xì)胞活性檢測取人吸脂術(shù)中吸出的脂質(zhì)部分,用緩沖液反復(fù)沖洗,剪刀剪碎。0.1%膠原酶37℃消化40min,期間需反復(fù)震蕩混勻1次,使用等量體積的完全培養(yǎng)基中和后,離心1300×g5min,去上清,沉淀混懸后使用肽盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性,加入10%DMEM培養(yǎng)基中,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長融合達(dá)80%即可傳代,取第3~4代細(xì)胞供實驗用。1.2.2培養(yǎng)液的消毒將膠原蛋白支架材料裁制成10mm×10mm×1mm大小,利用紫外線照射及酒精浸泡消毒,培養(yǎng)液平衡后待用。培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為2×105/ml,表面種植0.2ml細(xì)胞懸液,靜置4h后,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.3獨立顯微鏡觀察1.2.4kasen報道的方法用于確定細(xì)胞的依賴度1.2.5加材料空白對照組將膠原支架材料7塊(5mm×5mm×1mm)分別置于96孔培養(yǎng)板中,并設(shè)7孔為不加材料的空白對照組,各4個復(fù)孔。將ADSCS以1×104/孔接種于材料及空白孔,置37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)3、5、7d,以主波長450nm,參比波長630nm在酶標(biāo)儀上比色,測定吸光度A值。1.2.6掃描電子觀察1.2.7統(tǒng)計處理2結(jié)果2.1培養(yǎng)時間和支架對細(xì)胞毒性的影響剛接種的細(xì)胞呈圓形,在支架材料內(nèi)均勻分布;透光性差,24h內(nèi)細(xì)胞伸展、黏附,透光性增加,不易觀測。2~3d已完全伸展變形,以三角形和梭形為主,呈網(wǎng)狀排列;隨著培養(yǎng)時間的延長,支架上的細(xì)胞逐漸由梭形變成圓形,種植7d后,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,極少細(xì)胞從支架上掉落。表明脂肪干細(xì)胞能在支架上良好地附著、生長和增殖(圖1)。2.2子粘附率的檢測經(jīng)檢測,7塊復(fù)合材料中,每塊細(xì)胞黏附率均達(dá)95%以上,平均達(dá)97.9%,說明該支架對細(xì)胞有良好的黏附性。2.3細(xì)胞接種后細(xì)胞活性檢測從活細(xì)胞吸光度所繪制的細(xì)胞增殖柱形圖來看(圖2),細(xì)胞接種后,實驗組和空白組隨時間延長細(xì)胞活性逐漸增加,仍可保持正常的分裂增殖速度,兩組之間組相比未見顯著性差異(P>0.05)。2.4表面拉伸、黏附細(xì)胞種植3d后,細(xì)胞呈扁平多角形或圓形,在材料表面伸展、黏附;種植1周后,形態(tài)為梭形或圓形,細(xì)胞數(shù)量明顯增多,呈聚集性分布,細(xì)胞周圍有大量基質(zhì),表明脂肪干細(xì)胞在支架上粘附、伸展和生長良好(圖3)。3細(xì)胞活性成分的檢測膠原蛋白是目前組織工程學(xué)研究中最常用的天然生物材料,由多種糖蛋白分子組成,占機(jī)體總蛋白的30%(85%為I型膠原蛋白),它具有多方面的生物活性,不僅是組織支持物,而且是細(xì)胞外間質(zhì)的重要成分。研究表明,膠原蛋白生物相容性好,降解速度可調(diào),而且可參與組織修復(fù),是一類優(yōu)良的可引導(dǎo)組織再生的生物材料。Ⅰ型膠原作為體外細(xì)胞培養(yǎng)支架時,有促進(jìn)細(xì)胞粘附和誘導(dǎo)生長分化的作用,是良好的培養(yǎng)粘附劑。其降解產(chǎn)物可被細(xì)胞利用合成新的基質(zhì)。不產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物,不影響內(nèi)環(huán)境pH值,因此不會影響細(xì)胞的生長增殖。膠原蛋白及相關(guān)制品已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中,已被美國FDA批準(zhǔn)作為人工皮膚材料。本研究利用人脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,進(jìn)行體外細(xì)胞種植膠原支架,通過倒置顯微鏡和電鏡觀察細(xì)胞伸展、黏附和生長過程。鏡下顯示,種子細(xì)胞種植膠原材料后,生長狀態(tài)良好,無明顯細(xì)胞毒性表現(xiàn),在培養(yǎng)條件相對穩(wěn)定的情況下,細(xì)胞可以進(jìn)行正常增殖、遷移并分泌細(xì)胞外基質(zhì)。通過檢測,細(xì)胞與支架的黏附率達(dá)97%以上,說明該支架對細(xì)胞有良好的親和性。XTT法常用于體外細(xì)胞增殖和藥敏檢測,通過測定活細(xì)胞光吸收值,間接反映活細(xì)胞數(shù)量。本實驗中,細(xì)胞支架培養(yǎng)復(fù)合培養(yǎng)后,材料接種組細(xì)胞的增殖未受到不良影響,說明I型膠原支架對人脂肪干細(xì)胞無毒性作用。本實驗表明,人脂肪干細(xì)胞能在I型膠原支架材料上良好的附著、生長、增殖并在三維支架材料內(nèi)保持均勻分布。I型膠原支架材料與人脂肪干細(xì)胞具有良好的體外生物相容性,可作為構(gòu)建脂肪組織工程的細(xì)胞載體。細(xì)胞接種支架后,動態(tài)觀察細(xì)胞在支架上粘附、伸展、生長、分裂情況。根據(jù)Kasten報道的方法做了部分改進(jìn)。取24孔培養(yǎng)板,在孔內(nèi)植入備用的膠原蛋白支架材料7塊,大小約10mm×10mm×1mm。將細(xì)胞濃度為2×105/ml的細(xì)胞懸液0.2ml滴加到材料上,靜置4h后,置于孵育箱中復(fù)合培養(yǎng)4h,換于另一平皿,加入培養(yǎng)液,將原平皿中細(xì)胞消化收集,計數(shù)儀計數(shù),得出流失的細(xì)胞數(shù);細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)24h后,在培養(yǎng)液中輕輕晃動,換于另一平皿,重復(fù)上述步驟,得出未黏附細(xì)胞數(shù)。粘附率=(接種細(xì)胞數(shù)-流失細(xì)胞數(shù)-未粘附細(xì)胞數(shù))/