大鼠灌注固定取腦,解剖取材

大鼠灌注固定取腦

主講：陳爽2017.9.12用途1.用于常規(guī)HE染色，免疫組化分析。

2.冰凍切片可以不做腦組織固定。

3.不可用于westernblot和PCR。

4.如果觀察腦組織的缺血、損傷或其它病變時，不作灌注

固定，而是在取出腦組織后作固定，將大大影響效果。原理

心臟灌流術能夠快速沖凈血液并在動物死亡前進行組織的前固定,避免了組織的自溶現(xiàn)象,是腦組織切片觀察的常用方法。多聚甲醛使組織蛋白發(fā)生交聯(lián)，以保持蛋白的原位和表面結構不變，從而能使其對應的抗體，準確檢測其表達的位置和量。

必要性

1.腦組織較軟，且細胞成分不易保留，腦組織是較易軟化的組織之一，血供也較為豐富，所以最好是在取腦組織前用4％多聚甲醛灌注固。

2.經(jīng)前固定后，取腦操作時，可減少腦組織損傷。

3.腦內血液都在，HE染色后，可去除紅細胞背景影響流程

麻醉開胸心尖向左心室穿針

剪開右心耳生理鹽水沖洗

4%多基甲醛固定取腦保存或切片.

具體過程大鼠經(jīng)深度麻醉后，固定于自制的手術木板置于解剖盤中,開胸暴露并游離出心臟,經(jīng)左心室插入灌流針并固定,切開右心耳,先灌注冰凍無菌生理鹽水(4℃)XmL，直到肝和肺臟顏色轉白及右心房流出液澄清,后再灌注冰凍(4℃)4%多聚甲醛XmL,斷頭取腦,多聚甲醛浸泡固定24小時。1.多聚甲醛的配置：一般方法為：4％多聚甲醛PBS緩沖液配法：稱取40gPFA溶于裝有500mlDEPC水的玻璃容器燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至60～65℃，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮狀（滴加），再加入約500mlPBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測一下pH，過濾后定容至1000ml，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。簡便方法：先配好PBS，稱好相應的多聚甲醛，37℃水浴或溫箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期間不時震蕩。注意，4%的多聚甲醛需臨用前配制,配制后需過濾去除小的雜質,避免心臟灌流時造成栓塞影響灌流效果。也可用10%福爾馬林溶液，甲醛1：10稀釋甲醛100ml磷酸二氫鈉4g磷酸氫二鈉6.5g蒸餾水900ml

或甲醛100ml加900mlPBS緩沖液。2.制作灌注裝置，用兩瓶塑料包裝的輸液瓶裝灌注液。同時配好輸液器備用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的劑量腹腔注射麻醉動物。4.沿兩側肋弓剪開皮膚，打開腹腔，用止血管鉗夾持劍突并向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成人工氣胸，然后向兩側順延，剪斷膈肌及肋骨，夾持劍突的血管鉗將劍突連帶胸廓上翻固定，充分暴露心臟，直視下穿刺針左心室心尖處，用血管鉗固定。5.快速滴注生理鹽水(室溫)，同時剪開右心耳。約注入100~150mL，至流出液體血色較淺基本澄清，停止灌注。肝臟、眼珠、爪子迅速變白是排出血液的有效觀察指標。6.繼續(xù)用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的腦組織置于4％PFA置4度冰箱內進行后固定，時間>2h，過夜最好省時省劑的方法夾閉腹主動脈：只灌注上肢及頭腦，固定的好又快，又省試劑。先灌注生理鹽水約100ml，見到老鼠兩前肢及兩肺變白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。

灌注成功的標志：剛開始灌注時老鼠前肢劇烈抽動（下肢不抽動證明腹主動脈夾閉完全）；前肢及頸部僵硬；所灌注的腦組織白而硬大鼠腦組織取材步驟1.剪開皮膚2.用鉤鑷再眼眶處固定大鼠顱骨，用組織剪再顱骨和頸椎連接處剪斷3.組織剪頭部伸入枕骨大孔，盡量貼著骨頭（不能插太深傷到腦組織）。4.組織剪從