污水厭氧處理技術(shù)

污水厭氧處理技術(shù)四環(huán)素是一類水體中常見的廣譜抗生素,它能與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合,阻止氨?；鵷RNA同核蛋白體結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)的合成。同時,四環(huán)素類藥物的廣泛使用引起了四環(huán)素耐藥細(xì)菌在環(huán)境中產(chǎn)生并快速傳播。至今,被發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素耐藥細(xì)菌有115屬、530種。不同來源廢水中四環(huán)素的含量差異較大,一般含量在幾十ng·L-1到幾百μg·L-1之間。近年來,四環(huán)素對污水處理系統(tǒng)的影響引起了廣泛關(guān)注。CETECIOGLU等在SBR中通過測定COD的含量和氣體的產(chǎn)量的變化發(fā)現(xiàn),當(dāng)四環(huán)素投加量低于8.5mg·L-1時,反應(yīng)器內(nèi)底物降解作用不受影響,但產(chǎn)氣量減小了10%~20%,說明四環(huán)素對系統(tǒng)中微生物造成了影響。AYDIN等在ASBR中通過測定甲烷產(chǎn)量和揮發(fā)性脂肪酸的積累量的變化發(fā)現(xiàn),不同濃度組合的四環(huán)素、紅霉素和磺胺對同型乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了不同程度的影響。AYDIN等在隨后的研究中又分別運用了real-timePCR和PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn),四環(huán)素、紅霉素、磺胺3種抗生素共同影響下產(chǎn)乙酸細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌存在互營關(guān)系且這種互營關(guān)系對反應(yīng)器的穩(wěn)定運行起關(guān)鍵作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)已被廣泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落結(jié)構(gòu)中。第2代IlluminaMiSeq高通量測序能克服傳統(tǒng)檢測方法的缺陷,具有通量高、錯誤率低、成本低、流程自動化、速度快等優(yōu)勢,目前已在研究微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)方面受到廣泛認(rèn)可;因此,將IlluminaMiSeq高通量測序方法應(yīng)用于污水處理系統(tǒng)的研究,對深入認(rèn)識污水處理系統(tǒng)具有實際意義。當(dāng)前,污水厭氧處理因其高效能、低能耗等特點在污水處理工程上開始受到關(guān)注。它實際上是借助于不同微生物種群間的協(xié)同作用,通過水解—酸化(產(chǎn)氫及產(chǎn)乙酸)—產(chǎn)甲烷等一系列生物反應(yīng)將有機底物轉(zhuǎn)化為甲烷和無機物的過程。在這個過程中,微生物群落構(gòu)成直接影響到污水處理的效果,因此,深入認(rèn)識污水厭氧消化系統(tǒng)的微生物群落構(gòu)成,對厭氧污水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定運行具有指導(dǎo)作用?；诖?本研究通過室內(nèi)模擬實驗,選擇ABR多相厭氧反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)流實驗,啟動反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后,分別在不含四環(huán)素和含有250μg·L-1四環(huán)素的人工配制污水條件下運行90d,通過考察來自反應(yīng)器的氫氣、甲烷產(chǎn)生量的變化,運用IlluminaMiSeq高通量測序方法對反應(yīng)器中的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析,研究四環(huán)素對污水厭氧處理系統(tǒng)微生物群落造成的影響,以期從微生物關(guān)系角度深入了解這種影響,為污水厭氧處理技術(shù)研究及工程實踐提供參考。1、材料和方法?1.1實驗裝置?ABR采用厚為5mm的有機玻璃板加工制成,尺寸為455mm×150mm×400mm,有效容積為21L,置于(35±1)℃的恒溫箱中。反應(yīng)器分為3個格室,按照前后順序分為格室1、格室2、格室3,分別命名為C1、C2、C3,每個格室由上、下流室(體積比為3∶1)組成,折流板底角為45°。格室體積比V1∶V2∶V3=1.5∶1∶1。每個格室上部設(shè)有集氣口,側(cè)部分別設(shè)有取水口、取泥口。1.2接種污泥?接種污泥取自某市瀝窖污水處理廠A2/O工藝的厭氧池。污泥MLSS=24.67g·L-1,MLVSS/MLSS=0.61,pH=6.58,含水率為97.30%。接種污泥體積為反應(yīng)器有效容積的1/3。1.3實驗用水?配水以葡萄糖為碳源,NH4Cl和KH2PO4分別為氮源和磷源,同時加入Ca、Mg、Fe、Co、Ni等微量元素,以保證微生物細(xì)胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHCO3以保證ABR內(nèi)的緩沖能力。反應(yīng)器以連續(xù)流方式進(jìn)水,水力停留時間(HRT)為24h。在啟動階段,采用逐步增加進(jìn)水負(fù)荷的啟動方式,進(jìn)水COD濃度為500~2000mg·L-1,當(dāng)COD去除率穩(wěn)定在80%以上、出水各項指標(biāo)(pH、堿度、VFA)趨于正常,啟動階段完成。反應(yīng)器的運行先后經(jīng)歷了啟動階段(56d)、穩(wěn)定運行階段(90d)、添加四環(huán)素(250μg·L-1)運行階段(90d)。1.4DNA的提取和PCR擴增及其微生物多樣性數(shù)據(jù)分析?分別在反應(yīng)器的穩(wěn)定運行階段和添加四環(huán)素運行階段每間隔18d從每個格室采集一次活性污泥樣本,分別命名為CtrlD18C1、CtrlD36C1、CtrlD54C1、CtrlD72C1、CtrlD90C1、TreD18C1、TreD36C1、TreD54C1、TreD72C1、TreD90C1,其中“Ctrl”代表未添加四環(huán)素運行時的污泥樣本,“Tre”代表添加四環(huán)素運行時的污泥樣本,“D18”代表第18天取樣,“C1”代表樣本取自格室1,格室2和格室3的樣本命名為C2和C3。實驗共從3個格室中共采集到30個活性污泥樣本。分別稱取0.4g污泥用于DNA提取。采用

MOBIOPowerSoilDNAIsolationKitDNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,提取步驟依據(jù)說明書操作,提取好的DNA保存于-20℃冰箱。以提取的基因組DNA作為模板,使用16SrRNA基因V4區(qū)特異性引物F515和R806進(jìn)行PCR擴增,擴增片段長度約為300bp。本實驗采用50μL的PCR反應(yīng)體系:1μL模板,各1μL的10μmol·L-1正向引物和反向引物(華大),0.2μL20mg·mL-1的蛋白質(zhì)(TaKaRa),25μL的PremixExTaqVersion(ExTaqVersion2.0plusdye)(TaKaRa),21.8μL滅菌水(TaKaRa)。PCR的反應(yīng)條件:94℃5min;94℃30s,52℃30s,72℃45s,31個循環(huán);72℃10min。將各樣品的PCR產(chǎn)物按照等摩爾量進(jìn)行混合,使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen,Chatsworth,CA,USA)凝膠回收試劑盒切膠回收PCR混合產(chǎn)物,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,最后使用IlluminaMiSeq高通量測序平臺進(jìn)行基因測序。測序結(jié)束后,首先,使用Trimmomatic(Version0.33)軟件去掉序列3′端連續(xù)的低質(zhì)量堿基。接著,用Mothur(Version1.35.1)中的“make.contigs”命令將兩端reads拼接成完整的目的DNA片段,再用“screen.seqs”,“trim.seqs”命令進(jìn)行錯誤序列的識別和修剪。最后,使用QIIME軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行微生物的多樣性分析,將得到的序列進(jìn)行聚類,將97%相似性的序列聚類成為OTUs(operationaltaxonomicunits)。物種分類由UCLUST(Version1.2.22)軟件和GreengenesOTU數(shù)據(jù)庫(gg_13_8_otus)實現(xiàn)。1.5反應(yīng)器氣體產(chǎn)生的分析?于固定時間每6d測定一次格室內(nèi)產(chǎn)生氣體中氫氣和甲烷的含量,檢測方法為氣相色譜法。使用儀器為安捷倫7820A氣相色譜儀,檢測器為TCD,色譜柱為TDX-01,色譜條件如下:進(jìn)樣口、色譜柱、檢測器的溫度分別為100、100和200℃;載氣為氮氣,流量為35mL·min-1;進(jìn)樣量為1mL。2、結(jié)果和分析?2.1四環(huán)素對反應(yīng)器內(nèi)氣體產(chǎn)生的影響?ABR3個格室中氫氣的產(chǎn)生情況如圖2所示。僅在格室1中檢測到氫氣的存在,而格室2和格室3中沒有檢測到氫氣的產(chǎn)生,這主要是由于格室1進(jìn)行的是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸反應(yīng),而后端格室主要進(jìn)行的是產(chǎn)甲烷反應(yīng)。未添加四環(huán)素運行時,格室1內(nèi)氫氣的平均產(chǎn)量為0.0102L·(g·d)-1(以MLSS計)。添加四環(huán)素后,氫氣產(chǎn)量是未添加四環(huán)素時氫氣產(chǎn)量平均值的4.05~6.89倍。說明四環(huán)素的添加能使氫氣產(chǎn)量增加。ABR3個格室甲烷產(chǎn)生情況,如圖3所示。在未添加四環(huán)素時,格室1、格室2、格室3的甲烷平均產(chǎn)量分別為0.3204、0.1462、0.0881L·(g·d)-1(以MLSS計)。顯然,甲烷產(chǎn)量在縱向上呈降低的趨勢。這與反應(yīng)器內(nèi)的底物分配有關(guān),格室1進(jìn)水有機物含量較高,隨著格室內(nèi)微生物的降解作用,有機物含量在縱向上隨著格室逐漸降低,有機物的減少使得甲烷產(chǎn)量在格室間縱向減小。添加四環(huán)素后,格室1、格室2、格室3的甲烷產(chǎn)量隨著運行時間的推移呈現(xiàn)不同程度的下降,分別是未添加四環(huán)素時對應(yīng)甲烷平均產(chǎn)量的43.90%~80.20%、27.18%~79.79%、38.24%~83.70%。通過對比四環(huán)素添加后同一個格室不同時間的甲烷產(chǎn)量變化,發(fā)現(xiàn)甲烷產(chǎn)量隨著運行時間的推移呈現(xiàn)下降趨勢,說明四環(huán)素對產(chǎn)甲烷的抑制作用隨著時間的推移增大。2.2微生物豐度分析?通過反應(yīng)器中獲取的DNA序列與GreengenesOTU數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,得出反應(yīng)器中微生物主要有16個屬,如圖4所示。分別為甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、密螺旋體屬(Treponema)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、長繩菌屬(Longilinea)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、梭菌屬(Clostridium)、浮霉?fàn)罹鷮?Planctomyces)、Blvii28、Paludibacter、AUTHM297、WCHB1-05、A17、W22。圖4可知,隨著四環(huán)素的添加,不同物種呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。其中,隨著四環(huán)素的添加,密螺旋體屬(Treponema)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、W22的豐度在3個格室內(nèi)均呈現(xiàn)增長的趨勢,說明密螺旋體屬(Treponema)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、W22對四環(huán)素具有一定耐藥性。密螺旋體屬(Treponema)能利用氫氣和二氧化碳轉(zhuǎn)化成乙酸。添加四環(huán)素后,如表1所示,格室1、格室2、格室3內(nèi)的密螺旋體屬(Treponema)分別是未添加四環(huán)素時相應(yīng)密螺旋體屬(Treponema)平均豐度的1.09~2.00倍、1.27~1.79倍、1.41~6.52倍,密螺旋體屬(Treponema)豐度的增加說明四環(huán)素的添加能促進(jìn)氫氣和二氧化碳轉(zhuǎn)化成乙酸的過程,有利于乙酸的積累。有研究表明,乙酸是微生物燃料電池生產(chǎn)電能的首選底物,1t生物質(zhì)可產(chǎn)出價值150美元的乙酸,卻只能產(chǎn)出31美元的甲烷;因此,在處理四環(huán)素污水時,可以充分利用密螺旋體屬(Treponema)的優(yōu)勢,增加乙酸積累,可以通過耦合系統(tǒng)將乙酸轉(zhuǎn)化為微生物燃料電池能源或作為發(fā)酵工業(yè)的原料,實現(xiàn)資源回收?；I桿菌屬(Syntrophobacter)是一類產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌,能將高級脂肪酸和醇類氧化分解為乙酸和H2。添加四環(huán)素后,如表1所示,除了格室1第18天和格室3第54天的互營桿菌屬(Syntrophobacter)比未添加四環(huán)素時平均豐度低,這可能是由于反應(yīng)器運行過程中其他條件擾動引起的,其他時間內(nèi)格室1、格室2、格室3內(nèi)的互營桿菌屬(Syntrophobacter)分別是未添加四環(huán)素時相應(yīng)互營桿菌屬(Syntrophobacter)平均豐度的1.37~2.04倍、1.00~3.95倍、1.48~2.98倍,互營桿菌屬(Syntrophobacter)豐度的增加說明四環(huán)素的添加有利于產(chǎn)氫過程,與2.1中氫氣產(chǎn)量增大的結(jié)論相印證。氫氣是一種清潔能源,具有燃燒熱值高、燃燒產(chǎn)物無污染的特點,具有很好的應(yīng)用價值;因此,在處理四環(huán)素污水時,可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本。脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)是一類硫酸鹽還原菌,它能利用金屬表面的有機物作為碳源,將硫酸鹽還原成硫化氫,加速金屬管材的腐蝕。添加四環(huán)素后,如表1所示,格室1、格室2、格室3內(nèi)的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)分別是未添加四環(huán)素時相應(yīng)脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)平均豐度的1.09~3.99倍、1.12~3.59倍、1.20~7.40倍,脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度的增加說明四環(huán)素的出現(xiàn)會加劇污水處理系統(tǒng)中金屬管材的腐蝕;因此,在處理四環(huán)素污水時,應(yīng)充分重視處理系統(tǒng)中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多而造成的損失。格室1內(nèi)的寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)、格室3內(nèi)的梭菌屬(Clostridium)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)隨著四環(huán)素的添加,豐度先減小后增加,如表2所示,在四環(huán)素添加初期,這些微生物物種在相應(yīng)格室內(nèi)受到的抑制作用較大,隨著時間的推移,所受抑制作用減弱,耐藥性增加,說明四環(huán)素的長期污染能使微生物的耐藥性發(fā)生改變。表1豐度隨四環(huán)素添加而增大的物種的豐度變化值表2豐度隨四環(huán)素添加先減小后增大的物種的豐度變化值2.3樣本的主坐標(biāo)分析(PCoA)和聚類分析?主坐標(biāo)分析(PCoA)能展示各個樣本間的差異大小,2個樣本在坐標(biāo)軸上的距離較近,則表示這2個樣本的物種組成較相似。圖5反映了未添加四環(huán)素時和添加四環(huán)素后樣本間物種的差異大小?？梢钥闯?主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是造成樣品的2個最大差異特征,貢獻(xiàn)率分別為25.82%和11.86%。未添加四環(huán)素時,C1、C2、C3的樣本分別聚在一起,C1和C2樣本之間距離較近,且和C3距離較遠(yuǎn),說明未添加四環(huán)素時,C1和C2的物種相似性較高,且這2個格室的物種和C3格室物種有一定差異。添加四環(huán)素后,C1和C3物種在初期有個漸變的過程,后期3個格室的樣本聚在一起,且與未添加四環(huán)素時有一定距離,說明四環(huán)素添加前后格室內(nèi)物種有較大差異,且隨著四環(huán)素的添加,3個格室間的物種組成相似性提高。樣品聚類分析圖(圖6)進(jìn)一步說明PCoA的結(jié)果,樣品越靠近,枝長越短,說明2個樣品的物種組成越相似。由圖6可以看出,未添加四環(huán)素時,C1和C2格室樣品距離較近,枝長較短,說明這2個格室間物種相似性較高,而C3格室的樣品在另一個分支上,距離較遠(yuǎn),枝長較長,說明C3格室的物種與C1、C2格室的物種具有一定的差異。隨著四環(huán)素的添加,C1和C3樣本在初期有個遠(yuǎn)離的過程,說明物種有個漸變的過程,在后期3個格室的樣本距離縮短,相互間枝長變短,說明在后期3個格室物種相似性增大,且添加四環(huán)素后的3個格室樣本與未添加四環(huán)素時的樣本分別位于不同的大分支上,說明四環(huán)素的添加使反應(yīng)器內(nèi)微生物產(chǎn)生較大變化。主坐標(biāo)分析(PCoA)和樣品聚類分析共同說明了四環(huán)素添加前后反應(yīng)器內(nèi)的微生物的物種組成具有較大差異,四環(huán)素添加后,隨著運行時間的推移,格室間微生物的物種組成相似性增大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象主要原因是:由于四環(huán)素耐藥物種的存在,使四環(huán)素添加后不具有四環(huán)素耐藥性的物種逐漸被四環(huán)素耐藥物種取代,隨著運行時間的推移,各格室內(nèi)耐藥物種增多,所以格室間物種相似性增大;由于耐藥物種逐漸取代了不耐藥物種,所以四環(huán)素添加前后反應(yīng)器內(nèi)微生物物種組成有較大差異。說明長期受抗生素污染的污水處理系統(tǒng)對微生物具有選擇性,使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,進(jìn)一步說明通過污泥馴化能減小抗生素對污水處理系統(tǒng)的不利影響。3、結(jié)論?本實驗采用實驗室人工配置污水,對具有3個格室的ABR進(jìn)行連續(xù)流實驗,啟動反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后,分別在無四環(huán)素配置污水和濃度為250μg·L-1的四環(huán)配置污水環(huán)境下運行反應(yīng)器90d,探討2種條件下氫氣(H2)、甲烷(CH4)產(chǎn)量的變化,并運用IlluminaMiSeq高通量