致病菌毒力基因的系統(tǒng)篩選方法

致病菌毒力基因的系統(tǒng)篩選方法微生物學(xué)教研室叢延gcong@毒力基因的定義/標(biāo)準(zhǔn)一個(gè)基因或其產(chǎn)物可以在致病株中查見，而在非致病株中沒有（或發(fā)生突變或不表達(dá)）；在致病株中失活該基因會(huì)減低其致病力；將該基因轉(zhuǎn)到非致病株中表達(dá)會(huì)提高其致病力；在致病株感染過程中，該基因會(huì)被調(diào)控表達(dá)；針對(duì)該基因產(chǎn)物的體液免疫或細(xì)胞免疫具有保護(hù)性作用。柯赫原則的分子版本Falkow,S.(1988)Rev.Infect.Dis.10,S274－S276Falkow,S.(2004)NatureReviewsMicrobiology2,67-72WassenaarTMetal.(2001)FEMSMicrobiolLett.201:1-7TrudyM.WassenaarandWimGaastra.Bacterialvirulence:canwedrawtheline?FEMSMicrobiolLett.2001,201:1-7毒力基因的類別病原菌有多少毒力基因?對(duì)鼠傷寒沙門菌的估測(cè)方法：轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變標(biāo)準(zhǔn)：毒力減弱1000倍結(jié)果：毒力基因比例為4%和7%（腹腔注射和灌胃）BoweFetal.AtleastfourpercentoftheSalmonellatyphimuriumgenomeisrequiredforfatalinfectionofmice.Infectionandimmunity

1998;66(7):3372-7毒力基因的數(shù)量：~200個(gè)已經(jīng)確認(rèn)：<20%近年發(fā)展的毒力基因篩選技術(shù)根據(jù)突變株毒力變化：轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)標(biāo)簽標(biāo)記的突變技術(shù)

Signature-taggedmutagenesis（STM）根據(jù)毒力基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)：體內(nèi)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子篩選：

差異熒光誘導(dǎo)技術(shù)Differentialfluorescenceinduction（DFI）體內(nèi)表達(dá)技術(shù)

Invivoexpressiontechnology（IVET）轉(zhuǎn)錄水平：基因芯片分析翻譯水平：體內(nèi)誘導(dǎo)抗原鑒定技術(shù)

Invivo-inducedantigentechnology（IVIAT）雙向電泳轉(zhuǎn)座的概念細(xì)菌轉(zhuǎn)座元件的類型細(xì)菌轉(zhuǎn)座的機(jī)制及其遺傳學(xué)效應(yīng)細(xì)菌轉(zhuǎn)座的應(yīng)用第一節(jié)轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)的應(yīng)用一、什么是轉(zhuǎn)座？轉(zhuǎn)座(transposition)是指細(xì)菌的一段可移動(dòng)的DNA片段，能在細(xì)菌的染色體、質(zhì)粒和噬菌體內(nèi)部或之間自行移動(dòng)。TransposableGeneticElement(轉(zhuǎn)座因子)Transposon（轉(zhuǎn)座子）Jumpinggene（跳躍基因）DonorsiteTargetsite轉(zhuǎn)座特點(diǎn)：轉(zhuǎn)座因子是基因組正常組分，以相對(duì)獨(dú)立的序列結(jié)構(gòu)存在于染色體、質(zhì)?；蛘呤删w中。轉(zhuǎn)座的發(fā)生不依賴于轉(zhuǎn)座因子和靶位點(diǎn)之間任何的序列同源性。原核生物和真核生物均有轉(zhuǎn)座因子。轉(zhuǎn)座可造成遺傳學(xué)效應(yīng)。二、轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的研究Dr.BarbaraMcClintockobservedsomehigh frequencysomatic mutationsobservedapparent reversion(mutant [yellow]backtowild- type[pigmented])reversioncouldbehigh frequencyAc/DsTransposonsinMaizeDissociationtransposonpurplecolorgeneActivatortransposon

轉(zhuǎn)座現(xiàn)象廣泛存在玉米基因組的20億個(gè)堿基對(duì)中，其中轉(zhuǎn)座因子就占了一半以上轉(zhuǎn)座子廣泛存在于從病毒、細(xì)菌到真核的高等動(dòng)植物細(xì)胞中人類基因組中轉(zhuǎn)座序列在35％以上三、細(xì)菌轉(zhuǎn)座元件的類別插入序列（InsertionSequence）類插入序列（IS-likeelement）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（CompositeTransposon）TnA家族轉(zhuǎn)座噬菌體（Mu

Bacteriophage）（一）插入序列InsertionSequence（IS）是最簡單的可移動(dòng)片段，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分；是一個(gè)自主的單位，由一段編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA序列和兩端的反向重復(fù)序列（invertedrepeatsequence）組成；IS轉(zhuǎn)座頻率為10-3～10-4/世代。命名方式：

IS＋編號(hào)長度700～2000bp每種IS元件具有不同序列，但有共同的組織形式插入序列IS1的結(jié)構(gòu)（二）類插入序列IS-likeelements

結(jié)構(gòu)和IS相似，但不獨(dú)立存在，而是作為復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩臂的組件。（三）復(fù)合轉(zhuǎn)座子CompositeTransposon命名：通常以Tn加上數(shù)字表示，如Tn903。結(jié)構(gòu):1.兩側(cè)重復(fù)順序就是IS或者類IS。

2.除轉(zhuǎn)座酶基因外還有其它表型基因，如：耐藥基因，使宿主具表型效應(yīng)。ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transpositionTn1681大腸桿菌熱穩(wěn)定毒素I基因552bpIRIRIRIR復(fù)合轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)示意圖IS1IS1（四）TnA家族：兩端為IR（Invertedrepeats）而非IS中間的編碼區(qū)不僅編碼抗性標(biāo)志，還編碼轉(zhuǎn)座酶和解離酶；進(jìn)行復(fù)制性轉(zhuǎn)座，分為兩步，分別由轉(zhuǎn)座酶和解離酶完成。如：Tn3和Tn1000（五）轉(zhuǎn)座噬菌體MuBacteriophage（巨型轉(zhuǎn)座子）噬菌體Mu是一個(gè)特殊的噬菌體，可以感染大腸桿菌；有裂解和溶原兩個(gè)生活周期；Mu前噬菌體整合到宿主染色體上的方式不是位點(diǎn)特異性重組，而是隨機(jī)的轉(zhuǎn)座機(jī)制。

隨著噬菌體的復(fù)制，新的拷貝以復(fù)制轉(zhuǎn)座方式隨機(jī)插入到宿主菌染色體各處不同位置。四、細(xì)菌轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)座機(jī)制及遺傳學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類：在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位，IS序列、復(fù)合轉(zhuǎn)座子等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。

1．非復(fù)制性轉(zhuǎn)座（nonreplicativetransposition）

這類轉(zhuǎn)座因子直接從原位點(diǎn)移到靶位點(diǎn)，同時(shí)在供體留下產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂的位點(diǎn)，這種類型的機(jī)制只需要轉(zhuǎn)座酶，這個(gè)雙鏈斷裂位點(diǎn)需要修復(fù)系統(tǒng)的識(shí)別和修復(fù)。

轉(zhuǎn)座子作為可移動(dòng)的元件被復(fù)制，一個(gè)拷貝保留在供體原來的部位不變；另一個(gè)拷貝則插入到受體的位點(diǎn)上，結(jié)果供體和受體都有一個(gè)轉(zhuǎn)座子的拷貝。

2復(fù)制性轉(zhuǎn)座（replicativetransposition）：

轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)：①轉(zhuǎn)座引起插入突變；②轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因（轉(zhuǎn)移重組）；③轉(zhuǎn)座可產(chǎn)生染色體畸變；④其它效應(yīng)：轉(zhuǎn)座引起切離效應(yīng)、外顯子重組等。

轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用：轉(zhuǎn)座子除了它本身的遺傳學(xué)效應(yīng)外，在許多方面是遺傳學(xué)研究中的一個(gè)有用的工具。如在插入突變、作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的供體、基因定位的標(biāo)記、菌株構(gòu)建、基因克隆等方面都可利用轉(zhuǎn)座子作為工具。五、細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用致突變的工具，用于研究細(xì)菌基因的功能高通量地篩選與某種特定功能有關(guān)的基因快速構(gòu)建細(xì)菌完整的單基因突變株庫STM法系統(tǒng)篩選病原菌的毒力基因應(yīng)用舉例1

高通量地篩選與某種特定功能有關(guān)的基因InfectionandImmunity,August2004,p.4888-4890,Vol.72,No.8

0019-9567/04/$08.00+0

DOI:10.1128/IAI.72.8.4888-4890.2004

Copyright?2004,AmericanSocietyforMicrobiology.AllRightsReserved.

BiofilmFormationInVitroandVirulenceInVivoofMutantsofKlebsiellapneumoniae

HeatherF.Lavender,JenniferR.Jagnow,andStevenClegg*

DepartmentofMicrobiology,CollegeofMedicine,UniversityofIowa,IowaCity,Iowa52242構(gòu)建克雷伯菌的轉(zhuǎn)座突變株庫檢測(cè)突變株的生物膜形成能力發(fā)現(xiàn)部分突變株不能形成生物膜研究路線對(duì)突變基因進(jìn)行定位對(duì)突變株的體內(nèi)毒力進(jìn)行檢測(cè)構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變株庫大腸桿菌

SM10(λpir)：pUTMini-Tn5(含轉(zhuǎn)座子片段)KmrRifs

肺炎克雷伯菌43816

KmsRifr自殺質(zhì)粒通過接合方式傳遞質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)座雙抗平板篩選肺炎克雷伯菌43816的轉(zhuǎn)座突變株

1tnp:transposase轉(zhuǎn)座酶2反向重復(fù)序列，Km耐藥基因3oriR6K:復(fù)制起點(diǎn)，只能在表達(dá)π蛋白的細(xì)菌中復(fù)制。（成為自殺質(zhì)粒）在大腸桿菌SM10(λpir)中復(fù)制4mobRP4:編碼與接合有關(guān)的酶，使質(zhì)粒通過接合方式傳遞給受體菌。質(zhì)粒pUTMini-Tn5的構(gòu)成大腸桿菌肺炎克雷伯菌K.pneumoniae:KmsRifr無轉(zhuǎn)座K.pneumoniae:KmrRifr發(fā)生轉(zhuǎn)座突變株＋質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座序列細(xì)菌染色體上的基因ACBACB’(基因失活)轉(zhuǎn)座細(xì)菌突變株生物膜形成能力的檢測(cè)

localizationofthemutationgenesP2P1P1P2TnP1P2RestrictionsiteRestrictionsiteChromosomalDNAdigestedwitharestrictionenzyme

Self-ligationandinversePCR(I-PCR)SequencingtheresultedPCRproduct反向ＰＣＲStrainSiteofTninsertionBiofilminvitroaVirulenceinvivob43816++MBM100yadH–+MHV1yciI––HFL100yhdH–+HFL101pduA–(+)c+實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)座子的優(yōu)點(diǎn)與普通誘變法如亞硝基胍誘變、紫外線照射誘變比較：誘變率較高。導(dǎo)致插入性單突變，不會(huì)出現(xiàn)化學(xué)誘變常出現(xiàn)的多重突變，有利于研究的準(zhǔn)確。插入序列已知，便于對(duì)失活基因定位。

轉(zhuǎn)座子的優(yōu)點(diǎn)與基因敲除法比較：高通量；操作簡單；適用于與某種功能有關(guān)的未知基因的篩選；而基因敲除則是對(duì)某一比較確定的基因進(jìn)行操作（至少知道序列）。轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)的缺點(diǎn)不同細(xì)菌可能需要不同的轉(zhuǎn)座子，且轉(zhuǎn)座子在基因組中插入方式必須是隨機(jī)的；有可能產(chǎn)生極效應(yīng)，需要確證實(shí)驗(yàn)；需要合適的篩選模型，操作應(yīng)簡單；討論如何尋找S.suis2型強(qiáng)毒株的黏附相關(guān)基因？選擇轉(zhuǎn)座子：Tn917Tn917隨機(jī)插入誘變與血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，篩選突變株定位突變基因同源重組構(gòu)建同一基因敲除株和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)

應(yīng)用舉例2

快速構(gòu)建完整單基因突變株庫

銅綠假單胞菌PA14的轉(zhuǎn)座突變株庫的建立PA14genomeismadeupofapproximately5,500non-essentialgenesByNicoleT.Liberati,DanG.Lee,JacintoM.VillanuevaandFrederickM.AusubelDepartmentofMolecularBiologyMassachusettsGeneralHospital兩種轉(zhuǎn)座子，避免插入的熱區(qū)流程示意圖轉(zhuǎn)座獲得突變株隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增突變基因序列突變株庫的篩選規(guī)模ThePA14TransposonInsertionMutantDatabase(/cgi-bin/pa14/mutants/retrieve.cgi)應(yīng)用舉例3

STM法篩選病原菌毒力基因STM(signaturetaggedmutagenesis)標(biāo)簽標(biāo)記突