表觀遺傳調(diào)控在腫瘤研究中的應(yīng)用

表觀遺傳調(diào)控在腫瘤研究中的應(yīng)用

在美國，從20世紀(jì)70年代開始，美國提出了一項(xiàng)患有癌的計(jì)劃已經(jīng)使用了30多年。世界上對腫瘤的發(fā)展機(jī)制有了初步的了解，但克服腫瘤仍然很重要。根本原因是對癌過程的深刻理解沒有得到真正的理解。過去人們一直認(rèn)為基因突變對腫瘤的形成具有非常重要的作用,并相繼發(fā)現(xiàn)了許多癌基因和抑制基因。隨著研究的不斷深入,越來越多的證據(jù)向“基因決定論”提出了挑戰(zhàn)。例如,同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組,如果這兩個孿生子在同樣的環(huán)境下成長,理論上兩人的氣質(zhì)和體質(zhì)應(yīng)該非常相似。然而許多孿生子在性格、健康等方面可以有很大的差異,并不符合經(jīng)典遺傳學(xué)理論預(yù)期的情況,這說明在基因堿基序列沒有發(fā)生變化的情況下,生物體的表型卻發(fā)生了改變,從而我們認(rèn)為包括腫瘤在內(nèi)許多疾病的形成是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程,涉及到各種基因如何響應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化,從而實(shí)現(xiàn)在時間和空間上表達(dá)的調(diào)控。近年來遺傳學(xué)中興起的一個前沿領(lǐng)域:表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)為人們解答這些問題提供了新思路。1影響基因轉(zhuǎn)錄活性的基因分子基因組含有兩類遺傳信息:一類是傳統(tǒng)意義上的遺傳信息,即DNA序列所提供的遺傳信息;另一類是表觀遺傳學(xué)信息,它提供了何時、何地、以何種方式去應(yīng)用遺傳信息的指令。早在1942年沃丁頓(WaddingtonCH)首次提出“Epigenetics”一詞,并指出表觀遺傳與遺傳是相對的,主要研究基因型和表型的關(guān)系。1987年,霍利迪(HolidayR)針對“Epigenetics”作出了更加系統(tǒng)性的論斷,即“沒有DNA序列變化的、可遺傳的基因表達(dá)改變”。真核細(xì)胞的基因組DNA在細(xì)胞核里是以染色質(zhì)形式存在的。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)是核小體,重復(fù)的核小體結(jié)構(gòu)加上連接DNA,通過組蛋白及其他非組蛋白蛋白進(jìn)一步地折疊、壓縮形成高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞生命活動的選擇性基因沉默或基因表達(dá)過程中,包裹于染色質(zhì)中的基因組DNA序列一般不發(fā)生改變,但細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可以發(fā)生高度動態(tài)變化,使一些特定基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性呈現(xiàn)相應(yīng)的改變。這種影響基因轉(zhuǎn)錄活性而不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)調(diào)控方式稱為表觀遺傳調(diào)控,其分子基礎(chǔ)有兩個方面:即針對DNA本身的修飾和對組蛋白的修飾。研究發(fā)現(xiàn)基因沉默或表達(dá)在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)上有一定的規(guī)律,如DNA甲基化總能在沉默染色質(zhì)上發(fā)現(xiàn);組蛋白的乙酰化促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄,而去乙?；种苹蜣D(zhuǎn)錄;組蛋白特定氨基酸殘基的甲基化可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄(如H3-K4)或抑制基因轉(zhuǎn)錄(如H3-K9、H3-K27)。2腫瘤表面形態(tài)特征的異常2.1啟動子區(qū)域的異常甲基化以DNA甲基化為代表的表觀遺傳修飾在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)生改變。所謂DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,Dnmt)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上。Dnmt1主要起維持甲基化作用,Dnmt3a和Dnmt3b則以從頭甲基化為主。多種基因的啟動子區(qū)和第一外顯子富含CpG,而CpG相對集中的區(qū)域稱之為CpG島。生理情況下,CpG島多為非甲基化,大部分散在的CpG二核苷酸則為甲基化狀態(tài)。細(xì)胞分裂復(fù)制的DNA子鏈必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)丶谆揎?否則其遺傳性不穩(wěn)定、易變異,其染色體脆性增加、易斷裂。通過對DNA甲基化模式的研究,人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中存在異常的DNA甲基化狀態(tài):基因組整體甲基化水平降低,導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性增加;組織特異性基因的啟動子區(qū)域出現(xiàn)從頭甲基化;癌基因多為不充分甲基化,導(dǎo)致重新開放或異常表達(dá);抑癌基因多為過度甲基化,從而表達(dá)受抑制。迄今為止,關(guān)于腫瘤抑癌基因的失活與該基因的啟動子區(qū)域(CpG島)的過度甲基化的直接關(guān)系有大量的報(bào)道。許多與細(xì)胞生長增殖相關(guān)的基因,如與細(xì)胞周期相關(guān)的基因pRB、p16、p15、p14ARF和p73,以及與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因,如O6-MGMT、BRCA1和hMLH1等,它們啟動子區(qū)域的異常甲基化都與該基因的失活有關(guān)。通常使用DNA甲基化酶抑制劑來治療癌癥,其療效可能是由于這些抑制劑恢復(fù)了抑癌基因的活性;但是這種導(dǎo)致DNA低甲基化的治療方式,可能在防止一些癌癥發(fā)生的同時,也會造成基因組的不穩(wěn)定并增加其他組織罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。這些都是需要進(jìn)一步深入研究的問題。2.2抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和重建基因組蛋白的修飾比DNA甲基化復(fù)雜得多,因?yàn)椴煌M蛋白(組蛋白H3和H4)的不同氨基酸(H3末端有7個Lys和2個Ser;H4末端有5個Lys和1個Ser)可以發(fā)生不同類型的修飾,包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等,它們都是組蛋白密碼的基本元素。在組蛋白的修飾中,研究最多的是乙酰化。乙?；揎棿蠖嘣诮M蛋白H3Lys的9、l4、l8、23和H4Lys5、8、12、l6等位點(diǎn)。組蛋白乙?；强赡娴膭討B(tài)過程,組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histoneaceytltransferase,HAT)將乙酰輔酶A(乙酰CoA)乙?；糠洲D(zhuǎn)移到核心組蛋白氨基末端上特定Lys殘基的ε-氨基基團(tuán)。氨基上的正電荷被消除,這時DNA分子本身所帶有的負(fù)電荷有利于DNA構(gòu)象的展開,核小體的結(jié)構(gòu)變得松弛。這種松弛的結(jié)構(gòu)促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與DNA分子的接觸,因此組蛋白乙酰化可以激活特定基因的轉(zhuǎn)錄過程。組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDAC)則移去組蛋白Lys殘基上的乙酰基,恢復(fù)組蛋白的正電性,帶正電荷的Lys殘基與DNA分子的電性相反,增加了DNA與組蛋白之間的吸引力,使啟動子不易接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,從而抑制轉(zhuǎn)錄。許多研究已證實(shí)了組蛋白高/低乙?；谀[瘤發(fā)生中起重要作用。一方面,人們發(fā)現(xiàn),組蛋白乙?；兔撘阴；淖兓c腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化有關(guān);另一方面,催化組蛋白乙?；腍AT(例如p300/CBP、pCAF、ACTR等)或催化組蛋白脫乙?；腍DAC可與一些癌基因和抑癌基因產(chǎn)物相互作用,從而修飾或介導(dǎo)這些產(chǎn)物對與細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的作用。Yang等研究了組蛋白低乙?；谀[瘤發(fā)生過程中的作用,證實(shí)E1a原癌蛋白通過干擾p300/CBP和p/CAF的生長抑制作用而刺激增殖,p300/CBP和p/CAF均有HAT活性。另外的研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑,如丁酸鹽和TSA能在體外誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系(包括胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、肺癌和白血病等)的生長停滯、分化或凋亡。在組蛋白的諸多修飾方式中,磷酸化主要影響信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。早在1991年,Mahadevan等就發(fā)現(xiàn),組蛋白H3的快速磷酸化常伴有c-fos和c-jun即刻早期(immediateearly,IE)反應(yīng)基因的活化。此后更多的證據(jù)表明,組蛋白H3Ser10磷酸化在真核生物的基因轉(zhuǎn)錄活化中起重要作用。ERK-MAPK途徑以及p38MAPK途徑均能誘導(dǎo)H3磷酸化。刺激ERK-MAPK信號傳導(dǎo)途徑后,c-fos基因的活化與H3的磷酸化有關(guān)。間接免疫定位研究亦證實(shí),ERK-MAPK信號途徑可誘導(dǎo)多個核位點(diǎn)磷酸化組蛋白H3陽性。其中部分位點(diǎn)的磷酸化H3可能參與了ERK-MAPK信號途徑引起的基因快速轉(zhuǎn)錄活化。此外H3Ser10磷酸化對有絲分裂的啟動非常重要,這種修飾發(fā)生在G2期初始階段,促使染色質(zhì)凝集。組蛋白乙?；土姿峄际强赡娴?。這兩種修飾方式的建立和去除對基因轉(zhuǎn)錄的影響正好相反。但是組蛋白甲基化一直被人們認(rèn)為是不可逆的過程,因?yàn)榻M蛋白在特異的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可以進(jìn)行甲基化修飾,但迄今尚未發(fā)現(xiàn)組蛋白脫甲基化酶。組蛋白H3的5個Lys(K4、K9、K27、K36、K79)和H4的1個Lys(K20)可被甲基化,其中H3-K9、H3-K27、H4-K20甲基化可以抑制基因表達(dá);而H3-K4、H3-K36、H3-K79甲基化則具有激活效應(yīng)[14～15]。組蛋白甲基化和DNA甲基化可聯(lián)合作用共同參與基因沉默,并通過DNA復(fù)制而傳遞下去。Xin等認(rèn)為DNA甲基化是在組蛋白甲基化的下游起作用,而Lehnertz等則提出了相反的報(bào)道。究竟兩者中哪一個是基因調(diào)控中的起始事件?或許在不同的生物體或基因中存在相異的答案。上述各種組蛋白修飾方式都參與了相應(yīng)基因的活化或抑制,并且這些修飾方式及作用不是獨(dú)立的,更多的時候可以通過協(xié)同或拮抗來發(fā)揮作用,例如組蛋白H3的Lys既可被乙?；部杀患谆?說明兩者間存在競爭性修飾,究竟采取何種修飾方式要視具體情況而定。3hdac抑制劑的應(yīng)用不同的人體組織發(fā)現(xiàn),肌肉或者肝臟中的同一種基因,其甲基化模式可以有非常明顯的差異。這一研究結(jié)果證實(shí)了DNA甲基化在不同組織上具有不同模式,這為腫瘤的早期診斷提供了一定的依據(jù)。從1999年開始,一些研究者將微陣列技術(shù)先后應(yīng)用于乳腺癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤CpG島甲基化研究,獲得的CpG島甲基化譜不僅可作為上述腫瘤患者的早期診斷指標(biāo),還與腫瘤的病理分型、藥物治療敏感性和預(yù)后判斷直接相關(guān)[18～20]。Schmiemann等通過甲基化特異性定量PCR(methylation-specificreal-timePCR,QMSP)檢測發(fā)現(xiàn)肺癌患者中存在APC、p16(INK4a)、RASSF1A等基因的甲基化狀態(tài)異常,并提出對于早期肺癌的診斷,QMSP技術(shù)是一種高度敏感且普遍實(shí)用的輔助方法。此外檢測腫瘤DNA的甲基化模式用于前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤的早期診斷也有相當(dāng)數(shù)量的報(bào)道[22～23]。由于表觀遺傳機(jī)制對腫瘤形成的基本原理的不同,抗腫瘤治療的策略也存在差異。遺傳性的變化是固定的,基因突變是不可逆轉(zhuǎn)的,而表觀遺傳不影響基因序列,因此腫瘤發(fā)生中的DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)改變是可以逆轉(zhuǎn)的。目前表觀遺傳所致的基因失活主要從兩個方面進(jìn)行治療:抑制DNA甲基化和抑制組蛋白的脫乙?；饔谩NA甲基化主要表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低和局部CpG島甲基化程度的異常升高,后者可導(dǎo)致某些抑癌基因的表達(dá)沉默,進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤或癌前病變中通過去甲基化處理則可以恢復(fù)這些基因的表達(dá),從而達(dá)到防治腫瘤的目的。特異性地抑制Dnmt活性,如競爭性底物(發(fā)夾式半甲基化寡核苷酸)、核苷類似物(5-aza、5-azadC)、小分子抑制物(SAH)、反義寡核苷酸等,可使CpG島甲基化轉(zhuǎn)錄失活的抑癌基因恢復(fù)功能,如p14、p15、p16、p21、p53、Rb等,從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性。5-aza和5-aza-dC可以有效抑制Dnmt活性,在白血病、骨髓增生異常綜合征、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中已經(jīng)取得了很好的療效。盡管靶向Dnmt的去甲基化藥物取得了可喜的成績,但仍有一些問題需要解決,如核苷酸類似物的細(xì)胞毒性、寡核苷酸在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)作用的穩(wěn)定性與長期療效等。另外DNA甲基化抑制劑缺乏特異性,可能導(dǎo)致原本處于抑制狀態(tài)的一些基因恢復(fù)活性,這都影響了甲基化抑制劑的臨床應(yīng)用。自20世紀(jì)90年代以來,越來越多的HDAC抑制劑被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。丁酸鹽是第一個被驗(yàn)證的HDAC抑制劑,已被成功地應(yīng)用于癌癥治療的實(shí)驗(yàn)性研究,并有一定的療效;另一類應(yīng)用廣泛的抑制劑為氧肟酸類,如TSA和SAHA,它們的特異性較強(qiáng),所需濃度較低,因此應(yīng)用較廣。HDAC抑制劑抗腫瘤機(jī)制包括阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞分化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制血管生成等。已有多種HDAC抑制劑進(jìn)行了I期和II期臨床試驗(yàn),包括丁酸鹽、SAHA、MS-275、CI-994等。用HDAC抑制劑對白血病和實(shí)體瘤進(jìn)行治療,顯示了良好的療效,副作用很少,這說明與傳統(tǒng)的化療藥物相比,HDAC抑制劑具有較大的優(yōu)勢。近年來的研究表明HDAC抑制劑和其他抗腫瘤藥物的聯(lián)合使用具有更加廣闊的應(yīng)用前景。例如聯(lián)合應(yīng)用Dnmt抑制劑和HDAC抑制劑可以重新激活MLH1、TIMP3、CDKN2B、CDKN2A和ARHI等抑癌基因,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[28～29]。Shaker等將TSA和5-aza-dC聯(lián)用治療白血病,可以減少5-aza-dC的毒副作用,并達(dá)到協(xié)同增效作用。HDAC抑制劑與vitaminD類似物1,25-二羥維生素D聯(lián)合使用在體外可以促使腫瘤細(xì)胞的分化,在體內(nèi)可以抑制腫瘤的生長。腫瘤的發(fā)生常常涉及多個抑癌基因的失活,針對單一基因的治療不足以抑制腫瘤生長,甲基化或脫乙?；敢种苿┽槍Φ氖钦麄€基因組而不是特定的基因,可同時恢復(fù)多個抑癌基因的表達(dá),并降低基因突變的發(fā)生率,提高基因組穩(wěn)定性,可能為藥物開發(fā)提供新的靶點(diǎn)。4人類表觀基因組計(jì)劃隨著人類基因組計(jì)劃的完成,生命科學(xué)正在闡明遺傳信息是如何通過基因的選擇性表