光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷史

光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷史、現(xiàn)狀與趨勢楊拓拓（蘇州大學(xué)現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)研究所，江蘇蘇州215000）1基本原理顯微鏡成像原理及視角放大率顯微鏡由物鏡和目鏡組成。物體AB在物鏡前焦面稍前處，經(jīng)物鏡成放大、倒立的實像A'B'，它位于目鏡前焦面或稍后處，經(jīng)目鏡成放大的虛像，該像位于無窮遠(yuǎn)或明視距離處。牛頓放大率公式：x'x=f'fx是像點到像方焦點的距離，x是物點到物方焦點的距離。根據(jù)牛頓放大率公式可得物鏡的垂軸放大率為目鏡的視覺放大率為：250r=2f'組合系統(tǒng)的放大率為11250Ar=0r二—12f'f'12顯微鏡系統(tǒng)的像方焦距250廣一f顯微鏡系統(tǒng)成倒像軸向放大率若物點A沿光軸移動很小的距離，則通過顯微鏡系統(tǒng)的像點A2將移動很大的距離，且移動方向相同。顯微系統(tǒng)的角放大率即入射于物鏡為大孔徑光束，而由目鏡射出為小孔徑光束。顯微鏡的孔徑光闌單組低倍顯微物鏡，鏡框是孔徑光闌。復(fù)雜物鏡一般以最后一組透鏡的鏡框作為孔徑光闌。對于測量顯微鏡，孔闌在物鏡的象方焦面上，構(gòu)成物方遠(yuǎn)心光路。顯微鏡的視場光闌和視場在顯微物鏡的象平面上設(shè)置了視場光闌來限制視場。由于顯微物鏡的視場很小，而且要求象面上有均勻的照度，故不設(shè)漸暈光闌。顯微鏡是小視場大孔徑成像，為獲得大孔徑并保證軸上點成像質(zhì)量，顯微鏡線視場不超過物鏡的1/20,線視場要求：2y<f=20200顯微鏡的分辨率和有效放大率光學(xué)儀器分辨率瑞利判據(jù)：兩個相鄰的“點”光源所成的像是兩個衍射斑，若兩個等光強(qiáng)的非相干點像之間的間隔等于艾里圓的半徑，即一個像斑的中心恰好落在另一個像斑的第一暗環(huán)處，則這兩個點就是可分辨的點。當(dāng)物面在無窮遠(yuǎn)時，以兩點對光學(xué)系統(tǒng)的張角可表示兩分辨點的距離，其值為：申=1.22九/D顯微鏡的分辨率分辨率是指在物體表面能夠分解的最小間隔，兩個發(fā)光點的分辨率為1.22九0.61九G二=2nsinUNA數(shù)值孔徑（NA）越大，分辨率越高。顯微鏡的照明系統(tǒng)臨界照明聚光鏡應(yīng)有與顯微物鏡相同或稍大的NA,聚光鏡前放置的可變光闌為聚光鏡的孔闌改變孔闌大小，可改變進(jìn)入物鏡光束的孔徑角，使之與物鏡的NA相適應(yīng)。特點：光源經(jīng)過聚光鏡所成之像與物平面重合，相當(dāng)于物平面上置光源。缺點：光源表面亮度不均勻或明顯表現(xiàn)出燈絲的結(jié)構(gòu)，影響顯微鏡的觀察效果?？评照彰?/p>

光源經(jīng)聚光鏡前組成像在照明系統(tǒng)的視場光闌上，聚光鏡前組經(jīng)過聚光鏡后組成像于標(biāo)本處，同時也把照明系統(tǒng)市場光闌成像在無限遠(yuǎn)處使之與遠(yuǎn)心物鏡的入射光瞳重合。光源聚光鏡的聚光鏡前組孔徑光闌HSW聚光鏡后組標(biāo)木光源聚光鏡的聚光鏡前組孔徑光闌HSW聚光鏡后組標(biāo)木圖2-2科勒照明光路圖特點：把光源像成在物鏡入瞳面上。優(yōu)點：可消除臨界照明物平面上光照度不均勻的特點。顯微鏡的工作距離工作距離是指從物鏡前表面中心到被觀察標(biāo)本間滿足工作要求的距離范圍，與物鏡的數(shù)值孔徑成反比。一般情況下，物鏡的數(shù)值孔徑赿大，其工作距離赿小。SPIan1001.25Mil'□TK—羞戟片毎準(zhǔn)SPIan1001.25Mil'□TK—羞戟片毎準(zhǔn)flH(mm)SPlan11QX—0—4裘與雎文車—孔樓魏fl勺圖2-3顯微鏡工作距離示意圖發(fā)明發(fā)現(xiàn)公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時，可以使其放大成像，這為鏡頭設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。625年,斯泰盧蒂(FraneeseosteUuti)用，倍和10倍的放大鏡(即單式顯微鏡)詳細(xì)描繪出了蜜蜂各部分的圖形,由意大利拾荊學(xué)院(AcademyofLynxEye)出版圖,這是有關(guān)顯微鏡研究的第一部著作。第一架顯微鏡是荷蘭眼鏡工匠詹森父子在1590年前后制成的，但是并沒有發(fā)現(xiàn)顯微鏡的真正價值。由于初期的復(fù)式顯微鏡有嚴(yán)重的缺陷,荷蘭的列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek,1632一1723)將其畢生精力放在發(fā)展單式顯微鏡上,并將它用于生物觀察。這個傳奇式人物終于成了顯微鏡學(xué)家和微生物學(xué)的開拓者。發(fā)展階段英國科學(xué)家胡克自制顯微鏡，觀察細(xì)小物體，1665年出版的《顯微圖譜》引入“細(xì)胞”概念；1835年，英國科學(xué)家提出“愛里斑”的概念。由于光的衍射，即使一個無限小的發(fā)光點在通過透鏡成像時都會形成一個彌散的圖案，即愛里斑；1873年，阿貝和亥姆霍茲各自獨立發(fā)現(xiàn)正弦條件；1873年，阿貝從他的成像理論推導(dǎo)出關(guān)于顯微鏡分辨距離的公式，首先引用“數(shù)值孔徑”；1878年，阿貝設(shè)計制成油浸顯微鏡，顯微鏡的分辨本領(lǐng)已達(dá)到其理論極限(|im)020世紀(jì)的前半個世紀(jì)里,光學(xué)顯微鏡有如下兩個方面的發(fā)展，第一,為了觀察生物標(biāo)本的不同結(jié)構(gòu),提供多方面信息而設(shè)計成(或改良)一些特種顯微鏡；第二,僅為工作上的方便而設(shè)計成的一些特種顯微鏡0暗場顯微鏡暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)的聚光鏡中央有檔光片，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4nm~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。圖3-1暗視野照明方式韋納姆于1853年制成了簡單的暗場聚光器,西登托普夫和齊格蒙第于1903年采用了從單向側(cè)面照明的暗場觀察方法。暗場顯微鏡的進(jìn)一步發(fā)展是沿著改進(jìn)照明器的方向前進(jìn)的。1907年,西登托普夫制成一次反射拋物面型聚光器.他于1908年又為蔡司廠設(shè)計出心形面聚光器,同年蔡司廠還制成同心球面聚光鏡,這些都是暗場顯微鏡中優(yōu)良的聚光鏡。紫外顯微鏡使用紫外光源可以明顯提高顯微鏡的分辨率，對于生物樣品使用紫外光照明還具有獨特的效果。生物細(xì)胞中的原生質(zhì)對可見光幾乎是不吸收的，而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子對紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光顯微鏡研究單個細(xì)胞的組成與變化情況。1904年科勒制成紫外顯微鏡，它的分辨本領(lǐng)雖有所提高，但不能達(dá)到.而且技術(shù)復(fù)雜，價格昂貴。1941年布倫伯格第一次描述了“紫外彩色轉(zhuǎn)移顯微術(shù)”，可用紫外顯微鏡制成無色透明標(biāo)本的彩色圖像。偏光顯微鏡偏光顯微鏡是利用光的偏振特性，對具有雙折射性（即可以使一束入射光經(jīng)折射后分成兩束折射光）的晶體、液晶態(tài)物質(zhì)進(jìn)行觀察和研究的重要光學(xué)儀器。它的特點是光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的起偏器）。圖3-2偏光顯微鏡結(jié)構(gòu)1669年，丹麥的巴托林發(fā)現(xiàn)冰洲石的雙折射現(xiàn)象。1667年，惠更斯用光的波動理論來解釋此現(xiàn)象。1810年，馬呂斯發(fā)現(xiàn)反射光的偏振現(xiàn)象。1821年，費涅耳用光是橫波的理論來闡明“偏振光的干涉。1828年，英國人尼科耳用方解石制成尼科耳棱鏡，成為最重要的偏光元件之一。1834年，薛瓦利埃制成的消色差顯微鏡中已附有偏光元件。1865年，英人柯林斯根據(jù)哈利博士的設(shè)計制成哈利型顯微鏡，其中附有尼科耳棱鏡，可作為偏光顯微鏡使用。1928年，蘭德發(fā)明了偏振片后，現(xiàn)今絕大多數(shù)的偏光顯微鏡中已用偏振片代替尼科耳棱鏡了。熒光顯微鏡熒光顯微鏡(fluorescencemicroscopy)是以紫外線為光源來激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生能觀察到各種顏色熒光的一種光學(xué)顯微鏡。利用它可研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布。透射式熒光顯微鏡主要部件：汞燈光源、激發(fā)濾色鏡、暗場聚光鏡、吸收濾色鏡圖3-3透射式熒光顯微鏡實物圖

圖3-3透射式熒光顯微鏡原理圖落射式熒光顯微鏡主要部件：汞燈光源、激發(fā)濾色鏡、分色鏡、吸收濾色鏡圖3-5落射式熒光顯微鏡實物圖S8■比圖3-5落射式熒光顯微鏡實物圖S8■比H，Bl吐砂嵐卻盹叱片，闈圖平帶魯旳黃比<fi*}a釀律慳垢勻衛(wèi)■-SHIfiirnJMrt.1t.SIOii^ii計*的比Jh?H-向到皈財山止的比*a.忡冊圖3-6落射式熒光顯微鏡原理圖1578年，西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家莫納德斯第一次記錄了熒光現(xiàn)象。1852年,斯托克斯一1903）在考察奎寧和葉綠素的熒光時,發(fā)現(xiàn)熒光的波長大于激發(fā)光的波長（斯托克斯定則）。熒光fluoroscence）這一術(shù)語也是他提出的。1908年，試制成功第一臺熒光顯微鏡。1914年，有人用喳琳作染料處理纖毛蟲以增加其熒光,開辟了熒光染色的道路。由此開辟了熒光顯微術(shù)的廣闊道路（如熒光免疫技術(shù)）。1938年,用含紫外光特別豐富的超高壓汞燈為光源,為組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域中的熒光染色方法奠定了基礎(chǔ)。相襯顯微鏡相襯顯微鏡是利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差。用于觀察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本，光線只有通過染色標(biāo)本時其波長、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見，但活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本由于光的波長和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到。相襯顯微鏡可以將光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比。,vtlll'i物血.B,vtlll'i物血.B背At圖3-7相襯顯微鏡照明原理如上圖所示，相襯顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡多了2個部件：在聚光器上增加一個環(huán)形光闌；在物鏡后焦面增加一個相板，相板上有一個環(huán)形區(qū)，通過環(huán)形區(qū)的光比從其它區(qū)域透過的光超前或滯后1/4入，這樣就使通過標(biāo)本不同區(qū)域光波的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睢?935—1936年間，荷蘭物理學(xué)家塞爾尼克發(fā)現(xiàn)相襯法原理，并制成一種特殊裝置（環(huán)狀光闌和相板），這些裝置可使相位差轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈴?qiáng)差，使相位物體產(chǎn)生可見的影像。1936年，蔡司廠生產(chǎn)出第一臺相襯顯微鏡。塞爾尼克因此獲得了1953年諾貝爾物理學(xué)獎。1947年，0sterberk設(shè)計成功變偏光相襯顯微鏡也叫變色相襯顯微鏡。干涉相襯顯微鏡干涉相襯顯微鏡利用偏振光，有四個特殊的光學(xué)組件：偏振器、棱鏡、滑行器和檢偏器。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中安裝了石英Wollaston棱鏡，可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y）,二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同,引起兩束光發(fā)生光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Wollaston棱鏡（滑行器），把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置（檢偏器）,檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,使二者發(fā)生干涉。J7林本像TlfLf卜湘科斯僚槌璉J7林本像TlfLf卜湘科斯僚槌璉一---分允辭肇光辭了如III_一1光山「「兇I閹圖3-8干涉相襯顯微鏡光路圖1893年,荷蘭人西爾克斯提出干涉顯微鏡。1911年,薩亞尼克描述了第一個雙光束干涉顯微鏡。1931年,列別杰夫于在雅曼干涉折射計的基礎(chǔ)上改制成雅曼—列別杰夫型干涉顯微鏡。1952年,諾瑪斯基發(fā)明了諾馬斯基裝置,使用這一裝置的儀器叫做微分干涉相襯顯微鏡,成像比相襯顯微鏡清晰,且沒有光輪出現(xiàn)。激光掃描共聚焦顯微鏡20世紀(jì)后半個世紀(jì)，將激光技術(shù)引入顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計算機(jī)進(jìn)行圖像處理。共聚焦顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明孔形成點光源對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點掃描，照明孔與檢測孔相對于物鏡焦平面是共軛的焦平面上的點同時聚焦于照明孔和檢測孔，焦平面以外的點不會在檢測孔處成像，這樣就得到了標(biāo)本清晰的光學(xué)切面圖，克服了普通光鏡圖像模糊的缺點。共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別：抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像。具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片。增加側(cè)向分辨率。由于點對點掃描去除了雜散光的影響?！豕釯SM■孔圖3-9激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖近場掃面光學(xué)顯微鏡依據(jù)探針原理發(fā)展起來的一種掃描探針顯微技術(shù)（SPM）技術(shù)。分辨率突破光學(xué)衍射極限，達(dá)到10~200nm。其光學(xué)探針尖端的孔徑遠(yuǎn)小于光的波長。當(dāng)把這樣的亞波長光孔放置在近場區(qū)域時，可以探測到豐富的亞微米光學(xué)信息。采用孔徑遠(yuǎn)小于光波長的探針代替光學(xué)鏡頭，將小于波長的超分辨極限的精細(xì)結(jié)構(gòu)和起伏的信息從近場區(qū)的電磁場（隱失場）獲取。顯徴獄筒樣品臺XY擁描會—顯徴獄筒樣品臺XY擁描會—[fesiF?咒電倍增習(xí)激光束圖3-10近場掃面光學(xué)顯微鏡光路圖1928年，提出“近場探測原理”。1972年，等人在微波波段(入=3cm)實現(xiàn)了入/60()的分辨率。年，IBM的發(fā)明了STM。年，實現(xiàn)了SNOM分辨率為25nm。90年代后,Bell實驗室的解決了鍍Al膜的光纖超探針制備和針尖一樣品間距控制這兩個難題。倒置顯微鏡倒置顯微鏡(InvertedMicroscope)的組成和普通顯微鏡一樣，物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上。1867年，史密斯制成倒置顯微鏡用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和微生物研究。體視顯微鏡法國的奧伯豪澤爾于1840年前后制成了解剖顯微鏡.許多廠商就加以仿制和改進(jìn)。采用兩個物鏡和兩個目鏡的體視顯微鏡是蔡廠在美國動物學(xué)家格里諾的激勵下于1896年制成的,現(xiàn)在許多書上稱之為格里諾顯微鏡(greenoughmicroscope),它實質(zhì)上就是今天的小型體視顯微鏡。袖珍顯微鏡1665年,GinseppeCampani做成了一個木制的小顯微鏡,可視為袖珍顯微鏡的先驅(qū).1776年西森(Jeremiahsisson)根據(jù)Demai-nbray的設(shè)計制成了袖珍顯微鏡。重大事件16世紀(jì)末荷蘭眼鏡商Janssen父子發(fā)明原始光學(xué)顯微鏡，兩個凸鏡放在一個筒中，可以放大物體。荷蘭人AnthonyVonLeeuwenhoek和英國人RobertHooke在成像原理和實踐中不斷改進(jìn)，實現(xiàn)光學(xué)顯微鏡雛形。1665年胡克提出細(xì)胞概念。1835年，英國科學(xué)家提出“愛里斑”的概念。1873年，德國著名科學(xué)家ErnstAbbe提出了著名的阿貝光學(xué)衍射極限理論。1993年，EricBetzing發(fā)展了掃描近場光學(xué)顯微鏡，突破光學(xué)衍射極限2006年是超高分辨率熒光顯微鏡技術(shù)發(fā)展的重要一年,Betzing和Lippincott-Schwarz以及合作發(fā)明了基于熒光蛋白單分子定位原理的PALM技術(shù)；同時，哈佛大學(xué)莊小威研究組發(fā)表了基于熒光染料單分子定位的STOPM技術(shù);隨后,SamuelHess研究組也獨立發(fā)明了FPALM技術(shù)。本世紀(jì)研究成果與趨勢超高分辨率顯微鏡超高分辨率熒光顯微技術(shù)通過應(yīng)用一系列物理原理、化學(xué)機(jī)制和算法“突破”了光學(xué)衍射極限，把光學(xué)分辨率提高了幾十倍。超高分辨率熒光顯微技術(shù)大體可分為兩類，一類通過調(diào)制照明光斑縮小系統(tǒng)的點擴(kuò)散函數(shù)來實現(xiàn)超分辨成像，主要貢獻(xiàn)者包括諾貝爾獎得主StefanHell以及MatsGustafsson;另一類則是基于單分子定位的超分辨技術(shù)，主要貢獻(xiàn)者包括諾貝爾獎得主EricBetzig、以及哈佛大學(xué)莊小威教授和SamuelHess?；邳c擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨率技術(shù)受激發(fā)射損耗（TED）顯微技術(shù)基于受激發(fā)射損耗（STED）顯微技術(shù)，通過兩個脈沖激光，使樣品發(fā)射熒光的體積限制在非常小的范圍內(nèi)。通過減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點擴(kuò)散函數(shù)的半高寬來提高分辨率，成像突破衍射極限，分辨率先達(dá)100nm,再進(jìn)一步達(dá)到30nm分辨率。2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz[14]首次利用一種綠色熒光蛋白（GFP）的變種（PA-GFP）來觀察特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動軌跡。同年德國科學(xué)家EricBetzig認(rèn)識到，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來突破光學(xué)分辨率的極限。2000年，Hell用一束激光激發(fā)熒光分子發(fā)光，再用另一束環(huán)狀激光消除激發(fā)光周圍的熒光，實現(xiàn)了超高分辨率成像，將光學(xué)顯微鏡分辨率提高10倍。2008年超高分辨率熒光顯微鏡問世，史蒂芬?赫爾（Stefanw.Hell）、埃里克?本茨格（EricBetzig）和威廉?默爾納（William）因在超分辨率熒光顯微技術(shù)方面的貢獻(xiàn)共享了2014年的諾貝爾化學(xué)獎。飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturatedstruetureilluminationmicroscopy,SSIM)分辨率可以小于50nm。其原理是利用兩束強(qiáng)光干涉，使絕大多數(shù)熒光分子達(dá)到飽和，僅有干涉圖像陰影里的體積非常小的熒光未飽和，當(dāng)增加光強(qiáng)度，這些體積變得非常小，比任何PSF的寬度還小。2000年，美國科學(xué)家