6種病毒病檢測方法在脫毒馬鈴薯種薯質量檢測中的應用

6種病毒病檢測方法在脫毒馬鈴薯種薯質量檢測中的應用

我國甘薯生產(chǎn)領域的主要病毒有dvx、dvy、pvs、pclv、pva和pvm。本試驗選取烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯脫毒試管苗、原原種、各級良種共86個樣品,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(DAS-ELISA)方法對6種病毒進行檢測,分析烏魯木齊地區(qū)脫毒馬鈴薯各級種薯病毒攜帶情況,以便更好地了解本地脫毒馬鈴薯種薯質量。為有針對性地防治馬鈴薯病毒病提供理論依據(jù)。一、材料和方法1.試驗品種突變(1)馬鈴薯病毒檢測試劑盒。(2)試驗材料涉及費烏瑞它、大西洋、下寨65、中薯10號、中薯17號、紫花白、青薯2號、青薯9號等19個品種。試驗材料主要來源于烏魯木齊地區(qū)5個脫毒馬鈴薯主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn),材料表現(xiàn)為花葉、皺縮、壞死、卷葉、矮化等典型病毒病癥狀或疑似病毒病癥狀。所采集的樣品種類包括脫毒馬鈴薯試管苗、原原種及各級良種。(3)試驗儀器有微量移液器、冰箱、恒溫箱、高速離心機、酶聯(lián)儀等。2.樣品的提取和測定嚴格按照安德珍生物技術(北京)有限公司提供馬鈴薯病毒檢測試劑盒的說明書操作。(1)用包被緩沖液稀釋包被抗體,每孔100微升。(3)用PBST—磷酸鹽緩沖液+吐溫20(0.05%)洗板3次;洗板時將緩沖液充滿微孔,然后倒棄,重復2次,最后將孔板在干紙巾上拍干。(4)取1克樣品,加10毫升常規(guī)提取緩沖液,在研缽中碾碎提取;使用高速離心機沉淀使用上清液;樣品和提取液的比例是1克/10毫升。(5)在包被檢測孔中注入陽性和陰性對照物,每種樣品100毫升,所有樣品和對照都要做重復孔;陽性和陰性對照的制備是通過添加2毫升蒸餾水或去離子水,輕微搖晃而得。(6)用封口膜,包裹酶標板,4℃隔夜培養(yǎng)(至少16個小時)。(7)按上述第(3)條所述,清洗酶標板。(8)在洗板前按瓶上標簽所示用酶標緩沖液稀釋酶標抗體結合物,每孔加入100毫升稀釋好的酶標抗體。(9)用封口膜包裹酶標板,37℃溫育1小時。(10)按上述第(3)條所述方法洗板4次;這一步驟多洗1次是為確定清除掉所有未結合的酶標結合物,防止假陽性的出現(xiàn)。11底物應在使用前臨時制備:向底物緩沖液中加入pNPP,使其最終濃度為1毫克/毫升(5毫升緩沖液加1片5毫克的pNPP)。12每孔加入100毫升準備好的底物。13用封口膜將酶標板裹好,在室溫下避光培養(yǎng)1小時。14用酶標儀在405納米光度或595~650納米的光度(適用于)讀取吸光度。若吸光度大于陰性對照,則判斷為陽性,小于或等于陰性對照的判斷為陰性。二、結果與分析1.種薯病毒和pva檢出率由表1可知:檢驗的脫毒馬鈴薯試管苗樣品脫毒率為71.43%,其中PVX檢出率最高,為33.33%,其次是PVS,檢出率為21.43%,PVY檢出率為2.38%,PLRV、PVM、PVA檢出率為0%。病毒發(fā)生率PVX>PVS>PVY>PLRV、PVM、PVA。抽檢的原原種樣品合格率為100%。抽檢的大田種薯樣品脫毒率為53.13%,其中PVY檢出率為46.88%,其次是PVS檢出率為21.88%,PVX、PLRV、PVM、PVA檢出率為0%。脫毒試管苗PVX、PVS檢出率很高,而各級良種PVY檢出率最高,PVS次之。由此可推斷:在馬鈴薯脫毒過程中,PVS為較難脫除病毒,各級良種PVY檢出率遠遠大于試管苗與原原種,說明在大田開放環(huán)境條件下,馬鈴薯植株通過蚜蟲、機械、人為摩擦等方式感染病毒,所以病毒檢出率上升。2.pvs和pvy的復合感染率由表2可知:烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯脫毒試管苗PVX單獨侵染率最高,為26.19%,其次是PVS單獨侵染率為16.67%。PVS與PVY的復合侵染率為4.76%,PVY與PVX的復合侵染率為2.38%。檢測原原種的病毒侵染率為0%。檢測大田種薯PVY的單獨侵染率為28.13%,PVS單獨侵染率為3.13%。大田種薯病毒復合侵染現(xiàn)象比較嚴重,PVS與PVY復合侵染率為18.75%。當病毒單獨侵染馬鈴薯時,減產(chǎn)10%~20%,但是當病毒復合侵染馬鈴薯時可造成嚴重的減產(chǎn),最高可達80%左右。三、防治病毒病馬鈴薯病毒一經(jīng)侵染就很難防治,藥劑防治對病毒病大多無效,關鍵是要通過防止蚜蟲傳毒來有效防治病毒病。因此,對病毒侵染目前大多采用以下幾種措施控制:1.脫毒甘薯通過熱處理方法,莖尖剝離技術,再生苗組織培養(yǎng)技術,脫毒試管苗擴繁技術,及脫毒馬鈴薯原原種、原種、良種繁育技術生產(chǎn)脫毒種薯。2.病毒侵略源可以消除病毒侵染源有病毒寄生的雜草和其他作物、馬鈴薯植株及其殘余、當代病株等,應全部清除。3.加強耕作管理制種田遠離茄科、十字花科蔬菜田;及早發(fā)現(xiàn)病株,拔除病株;實行精耕細作,高壟栽培,及時中耕培土;避免偏