305-牛津杯法抑菌試驗(yàn)

牛津杯法抑菌試驗(yàn)1.原理將加有牛津杯的雙層平板置于培育箱中培育，一方面試驗(yàn)菌（病原菌）起先生長(zhǎng)繁殖，另一方面抑菌物質(zhì)呈球面擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度。牛津杯四周抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制，形成透亮的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌的抑制程度。.儀器、設(shè)備超凈工作臺(tái)恒溫培育箱:36±l℃o恒溫水浴鍋：50±l℃o局壓滅菌鍋。平皿：直徑為9cm。移液器（20?200匹,100-1000gL,1?5mL）及配套無(wú)菌槍頭。試管：15x150mm。酒精燈。試管架。渦旋混勻器。搖床：36±l℃o牛津杯。.病原菌、培育基及其他病原菌：大腸桿菌：ATCC25922、沙門氏菌:ATCC14028、金黃色葡萄糖球菌：ATCC6538o抑菌物質(zhì)：益生菌（乳酸菌、芽抱菌）、抗生素或其它抑菌物質(zhì)。培育基：（1）大腸埃希菌：養(yǎng)分肉湯、養(yǎng)分瓊脂半固體（瓊脂粉含量：1%）、養(yǎng)分瓊脂（瓊脂粉含量：2%）o（2）金黃色葡萄球菌：養(yǎng)分肉湯、養(yǎng)分瓊脂半固體（瓊脂粉含量：1%）、養(yǎng)分瓊脂（瓊脂粉含量：2%）o（3）沙門氏菌：養(yǎng)分肉湯、養(yǎng)分瓊脂半固體（瓊脂粉含量：1%）、養(yǎng)分瓊脂（瓊脂粉含量：2%）o（4）乳酸菌：MRS肉湯。（5）芽胞菌：養(yǎng)分肉湯。其它：0.85%滅菌生理鹽水，滅菌蒸儲(chǔ)水。4測(cè)定流程病原菌擴(kuò)培：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，挑取簇新的斜面保藏病原菌1環(huán)，接種于100mL無(wú)菌的養(yǎng)分肉湯培育基中，接種完畢，將三角瓶置于搖床內(nèi)固定，37℃,200rpm,培育16-20h。將培育好的病原菌菌懸液用空白養(yǎng)分肉湯培育基稀釋10倍，若OD600在之間，則為有效病原菌菌懸液，此時(shí)病原菌菌懸液原液中病原菌含量約為109cfu/mlo4.2抑菌物質(zhì)（抗生素或益生菌菌懸液）的制備：（1）抗生素：抗生素或其它藥物用無(wú)菌水稀釋至所須要的濃度。（2）乳酸菌擴(kuò)培：無(wú)菌條件下稱取相當(dāng)于約10億CFU量的乳酸菌菌粉（假如是包衣產(chǎn)品須要在稱樣前無(wú)菌條件下研磨釋放乳酸菌），接種于lOOmLMRS液體培育基中，37℃靜置培育24?48h即為擴(kuò)培好的乳酸菌菌懸液。（3）芽抱菌擴(kuò)培：無(wú)菌條件下稱取相當(dāng)于約10億CFU量的芽泡菌菌粉，接種于100mL養(yǎng)分肉湯培育基中，接種完畢，將三角瓶置于搖床內(nèi)固定，37℃ ,200rpm,培育14?18小時(shí)即為擴(kuò)培好的芽胞菌菌懸液。雙層平皿的制備：取 平 皿分別傾注養(yǎng)分瓊脂培育基15-18mL,使其在平板內(nèi)勻整攤布，放置水平臺(tái)面上使凝固，作為底層，將平皿倒置平均劃分區(qū)域并標(biāo)記添加物。另取半固體養(yǎng)分瓊脂培育基適量放冷至48s50C,將4.1中病原菌菌懸液原液稀釋至106cfu/mL左右，每4.5mL半固體養(yǎng)分瓊脂培育基加入0.5mL,倒入每平皿中，使其在底層上勻整攤布，作為菌層。放置在水平臺(tái)上冷卻后，在每1平皿中以劃分好的區(qū)域等距離勻整安置牛津杯4個(gè)備用。抑菌試驗(yàn)：取4.2步驟中準(zhǔn)備的抑菌物質(zhì)，每個(gè)雙層平皿中的牛津杯中分別滴裝200|iL,37℃靜置培育16-20h后，測(cè)量各抑菌圈直徑（或面積）以作出評(píng)價(jià)。選取典型平皿拍照片。備注：①牛津杯的放置確定要平穩(wěn)、到位，確保底部精確插到兩層平 皿之間；②抑菌物質(zhì)添加時(shí)確保全部加到牛津杯內(nèi)部，不要灑在牛津杯外壁或外部，假如灑在外面會(huì)形成乳酸菌或芽抱菌在抑菌圈的生長(zhǎng)；③假如無(wú)法限制乳酸菌或芽抱菌在牛津杯外面的生長(zhǎng)，可以將乳酸菌、芽胞菌菌 懸液在無(wú)菌離心管中離心，取其上清加入牛津杯中做抑菌試驗(yàn)。抑菌性能評(píng)價(jià)抑菌性：抑菌圈V10mm為無(wú)抑菌作用，抑菌圈＞1