鐵皮石斛檢測(cè)規(guī)程

鐵皮石斛多糖與甘露糖檢測(cè)規(guī)程鐵皮石斛TiepishihuDENDROBIIOFFICMALISCAULIS本品為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimu-raetM1go的干燥莖。11月至翌年3月采收，除去雜質(zhì)，剪去部分須根，邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀，烘干；或切成段，干燥或低溫烘干，前者習(xí)稱(chēng)“鐵皮楓斗”（耳環(huán)石斛）；后者習(xí)稱(chēng)“鐵皮石斛”?！拘誀睢胯F皮楓斗本品呈螺旋形或彈簧狀.通常為2?6個(gè)旋紋，莖拉直后長(zhǎng)3.5?8cm，直徑O.2?O.4cm。表面黃綠色或略帶金黃色，有細(xì)縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，易折斷，斷面平坦，灰白色至灰綠色，略角質(zhì)狀。氣微，味淡，嚼之有黏性。鐵皮石斛本品呈圓柱形的段，長(zhǎng)短不等?！捐b別】（1）本品橫切面：表皮細(xì)胞1列，扁平，外壁及側(cè)壁稍增厚、微木化，外被黃色角質(zhì)層，有的外層可見(jiàn)無(wú)色的薄壁細(xì)胞組成的葉鞘層?；颈”诮M織細(xì)胞多角形，大小相似，其問(wèn)散在多數(shù)維管束，略排成4?5圈，維管束外韌型，外圍排列有厚壁的纖維束，有的外側(cè)小型薄壁細(xì)胞中含有硅質(zhì)塊。含草酸鈣針晶束的黏液細(xì)胞多見(jiàn)于近表皮處。（2）取本品粉末1g，加甲醇50m1，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5ml使溶解，用石油醚（60?90°C）洗滌2次，每次20ml，棄去石油醚液，水液用乙酸乙酯洗滌2次，每次20ml，棄去洗液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取鐵皮石斛對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄WB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2?5〃l，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，使成條狀，以乙醇~丁酮-乙酰丙酮-水（15：15：5：85）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，烘干，噴以三氯化鋁試液，在105C烘約3分鐘，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)?！緳z查】甘露糖與葡萄糖峰面積比取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1ml含50ug的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取O.4m1，按［含量測(cè)定］甘露糖項(xiàng)下方法依法測(cè)定。供試品色譜中，甘露糖與葡萄糖的峰面積比應(yīng)為2.4?8.0。水分不得過(guò)12.O%（附錄IXH第一法）。取供試品2?5g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶中，厚度不超過(guò)5mm；疏松供試品不超過(guò)10mm；精密稱(chēng)定，打開(kāi)瓶蓋在100?105C干燥5小時(shí)，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱(chēng)定，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，稱(chēng)重，至連續(xù)兩次稱(chēng)重的差異不超過(guò)5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量（%）?？偦曳植坏眠^(guò)6.O%（附錄IXK）。測(cè)定用的供試品須粉碎，使能通過(guò)二號(hào)篩，混合均勻后，取供試品2?3g（如須測(cè)定酸不溶性灰分，可取供試品3?5g），置熾灼至恒重的坩堝中，稱(chēng)定重量（準(zhǔn)確至0.01g）,緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至500?600°C，使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中總灰分的含量（%）。如供試品不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸鐵溶液2ml，使殘?jiān)鼭駶?rùn)，然后置水浴上蒸干，殘?jiān)涨胺胱?，至坩堝?nèi)容物完全灰化?！窘鑫铩空沾既苄越鑫餃y(cè)定法（附錄XA）項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑，不得少于6.5%。按多糖取樣方法取供試品約4g（M），精密稱(chēng)定，置250ml的錐形瓶中，精密加乙醇100ml，密塞，稱(chēng)定重量，靜置1小時(shí)后，連接回流冷凝管，85C水浴加熱至沸騰，并保持微沸1小時(shí)。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱(chēng)定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)，精密量取濾液25ml，置已干燥至恒重（M1）的蒸發(fā)皿（或50ml帶蓋坩堝）中（體積不可超過(guò)蒸發(fā)皿的一半，以防蒸的時(shí)候溢出），在水浴上蒸干后，于105C干燥3小時(shí)，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱(chēng)定重量（M2）。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。計(jì)算：浸出物％=（M2-M1）/M*100/25*100%【含量測(cè)定】（一）多糖1.1試劑6%苯酚：先配置80%苯酚：80g苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光長(zhǎng)期儲(chǔ)存。再配置5%苯酚：取73ml80%苯酚于容量瓶中，加水至48g（每次測(cè)定均需現(xiàn)配），測(cè)定的時(shí)候就用5%的苯酚來(lái)測(cè)！1.1.2無(wú)水乙醇1.1.380%乙醇1.1.4濃硫酸1.2設(shè)備：10ml具塞試管，試驗(yàn)前檢查塞子的密封性，不得有泄漏，10至15ml離心管，使管口離離心液液面1cm以上，以防離心液甩出。1.2.3紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)1.2.4冰箱與冰塊1.2.5粉碎機(jī)，耐酸薄手套。2.2對(duì)照品溶液的制備2.2.1）取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.1g，精密稱(chēng)定，加水制成每1m1含100Mg的溶液，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0ml、0.1ml、O.2ml、O.4ml、O.6m1、O.8ml，分別置10ml具塞試管中（用前注意檢查塞子的密封性），各加水補(bǔ)至1.0ml，精密加入5%苯酚溶液1ml（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5ml,搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外一可見(jiàn)分光光度法（附錄VA），在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。20130723曲線y=0.0088x+0.1128,y為濃度.ug；x為吸光度。備注：1.檢測(cè)液位濃稠硫酸樣液，腐蝕性很強(qiáng)倒皿時(shí)一定小心不要弄到手上，最好帶上合適的手套。2.檢測(cè)液為濃稠硫酸樣液，且總體積只有7ml（共2皿），連續(xù)檢測(cè)多個(gè)樣品時(shí)，比色皿用水洗凈，盡量甩干，再用少量待測(cè)液潤(rùn)洗，待測(cè)樣品放在冰水浴中，測(cè)一個(gè)拿一個(gè)。3.試劑添加順序：樣品-5%苯酚-濃硫酸，不可顛倒；樣品加濃硫酸前要搖勻，加之后也要搖勻，注意塞子密封，小心漏液。4,用過(guò)的濃硫酸中會(huì)有炭絲，若檢測(cè)液中黑炭絲的顏色有擴(kuò)散的話，OD值會(huì)升高，需重處理復(fù)測(cè)。2.2.2供試品溶液的制備鮮莖100g以上，剪成2-3mm段，105°C鼓風(fēng)烘干，粉碎至過(guò)三號(hào)篩（50目），取本品共約O.3g，精密稱(chēng)定，加水200ml，加熱回流2小時(shí)，放冷，轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mI，置15ml離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10ml，搖勻，冷藏1小時(shí)，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20分鐘，棄去上清液（必要時(shí)濾過(guò)，觀察上清液是否有沉淀，若有再離心或過(guò)濾），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8ml，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20分鐘，棄去上清液，沉淀加60-80度熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法精密量取供試品溶液1m1，置10ml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1ml”起，依法測(cè)定吸光度A，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的量，計(jì)算，即得。多糖含量％=（A-0.1124）/0.0088*250*25/（2*m*1000000）*100其中（A-0.1124）/0.0088為檢測(cè)液濃度ug，250*25/（2*m）樣品稀釋倍數(shù)，1000000為單位換算系數(shù)1g=1000000ug。本品按干燥品計(jì)算，含鐵皮石斛多糖以無(wú)水葡萄糖（C6H12O6）計(jì)，不得少于25.O%。二）甘露糖照高效液相色譜法（附錄WB）測(cè)定。2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-O.02mol/L的乙酸銨溶液（19：81）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。理論板數(shù)按甘露糖峰計(jì)算應(yīng)不低于。t000。2.2試劑2.2.1鹽酸氨基葡萄糖內(nèi)標(biāo)溶液12mg/ml：300mg—25mlPMP（1-苯基-3-甲基-5-毗唑琳酮）甲醇溶液O.5mol/L：2.1775g-25ml氣溫低時(shí)稍稍加熱溶解鹽酸溶液O.3mol/L，3mol/L：3mol/L：25ml-100ml（校正到與3MNaOH濃度一致）氫氧化鈉溶液O.3mol/L，3mol/L：3mol/L12g-100ml2.3校正因子測(cè)定取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1ml含12mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1m1，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400p1，加O.5m01/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-毗唑琳酮）甲醇溶液與O.3mol/L的氫氧化鈉溶液各400p1，混勻，70°C水浴反應(yīng)100分鐘。再加O.3mol/L的鹽酸溶液500p1，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2ml（振搖1min），棄去三氯甲烷液（用潔凈干燥的2ml移液管吸取底部三氯甲烷），水層離心后，取上清液，0.45um針頭過(guò)濾器過(guò)濾，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算校正因子fi。fi=f內(nèi)/f甘=A內(nèi)/C內(nèi)：A甘/C甘其中A甘與A內(nèi)分別為標(biāo)樣中甘露糖和內(nèi)標(biāo)的峰面積，C甘與C內(nèi)分別為檢測(cè)液中甘露糖和內(nèi)標(biāo)的濃度mg/ml測(cè)定法取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩50目）約O.12g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4小時(shí)，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開(kāi)置于燒杯中，加水100ml（120ml），再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml，煎煮1小時(shí)并時(shí)時(shí)攪拌，放冷，加水補(bǔ)至約100ml（完全轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶定容），混勻，離心，吸取上清液1*4ml，置12ml頂空瓶中，加3.Omol/L的鹽酸溶液O.5*4ml，封口，混勻，110C水解1小時(shí)，放冷，用3.Omol/L的氫氧化鈉溶液0.5*4ml調(diào)節(jié)pH值至中性（用pH試紙測(cè)定），吸取400pl，照校正因子測(cè)定方法，自“加O.5mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10p1，（最好經(jīng)過(guò)0.45um針頭過(guò)濾器）注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。注意：轉(zhuǎn)移液體數(shù)量有限以上各移液管要干燥潔凈不要串用計(jì)算：甘露糖%=f