色譜分析法-課件

第十六章藥品質(zhì)量控制中的現(xiàn)代

分析方法與技術(shù)

基本要求

毛細管氣相色譜分析法

手性藥物的液相色譜分析法

核磁共振光譜分析法氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)9/25/20231第十六章藥品質(zhì)量控制中的現(xiàn)代

分析方基本要求一、熟悉毛細管氣相色譜法、手性藥物的高效液相色譜法的基本內(nèi)容及其在藥物分析中的應用。二、熟悉核磁共振光譜分析法的定量方法及其在藥物分析中的應用。三、了解毛細管電泳分析法、紅外光譜法、聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應用。9/25/20232基本要求一、熟悉毛細管氣相色譜法、手性藥物的高效液相色譜法的

毛細管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的毛細管柱，叫開管柱：固定液涂漬或固定化在柱管內(nèi)壁上，而載氣和其中的樣品從中心的通道上通過。柱材料主要是熔融石英（FSOT）。

一、高分辨氣相色譜法9/25/20233

毛細管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的（一）色譜柱

1．毛細管柱的類型：

柱類型柱內(nèi)徑柱長液膜厚度

普通開管柱0.2～0.53mm5～60m0.1～1.0μm

壁涂開管柱

多孔層開管柱

擔體涂漬開管柱

微內(nèi)徑開管柱﹤100μm

大內(nèi)徑開管柱0.32mm1μm或5μm

9/25/20234（一）色譜柱

1．毛細管柱的類型：

柱類型2．毛細管柱的選擇

常用的固定液有：SE-31、OV-1、SE-54、SE-52、OV-1701、Carbowax20M。

柱的選擇：根據(jù)樣品組分的沸點，一般地，相差2℃或2℃以上的組分，采用非極性毛細管柱分離；若沸點相差在2℃以內(nèi)的組分，則需在極性較大的毛細管柱上分離。

9/25/202352．毛細管柱的選擇

常用的固定液有：SE-31、OV-1、S3．毛細管柱的性能評價

評價指標：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定性。

評價方法：在一定的色譜條件下，分離各種測試物質(zhì)，獲得的特征性數(shù)據(jù)和峰對稱性，以此來評價柱效和表面活性。在測定了柱效和表面活性之后，用流失速率試驗來評價熱穩(wěn)定性。

9/25/202363．毛細管柱的性能評價

評價指標：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定（二）進樣方式

分流進樣：使用方便，對分流比、進樣溫度

樣品和載氣的情況、進樣體積和

濃度、進樣重復性需要注意。

不適于痕量分析和寬沸程樣。

適合大多數(shù)類型的樣品，樣品濃濃高、各組分的濃度相近

9/25/20237（二）進樣方式

分流進樣：使用方便，對分流比、進樣溫度溶液直接進樣進樣口溫度應高于柱溫30~50；采用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣，進樣量一般不超過數(shù)微升，色譜柱越細，進樣量應越少，毛細管氣相色譜法中，一般應分流以免過載。頂空進樣適用于固體和液體供試品中揮發(fā)性組分的分離和測定。供試液在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在非氣態(tài)和氣態(tài)達到平衡后，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。9/25/20238溶液直接進樣進樣口溫度應高于柱溫30~50；采用微量注射不分流進樣：須利用溶劑效應或冷阱，操作較難

特別適用于痕量分析和寬沸程樣品

柱頭進樣：必須使用外徑為0.17～0.23mm的

細針，柱內(nèi)徑必須大于0.32mm,

不能通過隔墊進樣，緩慢進樣

對熱不穩(wěn)定、稀的和寬沸程樣品較

理想；能給出定量結(jié)果

非揮發(fā)物在柱的中積累導致柱變性

和柱效損失

9/25/20239不分流進樣：須利用溶劑效應或冷阱，操作較難

直接進樣：樣品無須事先濃縮，進樣器溫度可較低，載氣消耗量小，分析所需樣量小適用于濃度范圍要比不分流進樣寬一個數(shù)量級以上的樣品，有利于對熱不穩(wěn)定的樣品；當樣品中含有揮發(fā)性低的組分時，難于定量分析

9/25/202310直接進樣：樣品無須事先濃縮，進樣器溫度可較8/8/2023

（三）應用示例----人尿中勞拉西泮的檢測

1.測定意義：勞拉西泮(簡稱LRZ)上用為催眠、鎮(zhèn)靜和抗癲癇藥物,常被犯罪分子作為麻醉藥物用于麻醉搶劫等麻醉后犯罪。為了確證這類案件的性質(zhì),經(jīng)常需要對受害人的血、尿等體液中麻醉藥物或其代謝物進行檢測。人體攝入該藥后其血液中藥物濃度較低,且犯罪分子所用藥量一般不使受害人死亡,而且此類案件一般報案較遲，因此血中藥物濃度較低,對其檢測較為困難。該藥主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。

9/25/2023118/8/202311

2.色譜條件：HP-5毛細管柱(30ｍ×0.32mm,膜厚0.1μｍ)。氮磷檢測器,不分流進樣(閥關(guān)閉時間0.75min),進樣口溫度:280℃,柱溫:200℃(1min)20℃/min280℃(15min),載氣為高純氮(2.2ｍml/min),尾吹氣為高純氮(10ml/min)。9/25/202312

2.色譜條件：HP-5毛細管柱(30ｍ×0.32mm3.樣品預處理----酶解及萃取

取檢尿1ml,加10mg/L的羥乙基氟西泮(HEF)標準工作液10μl,再加pH4.8的乙酸鹽緩沖液50μl及β-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1μl,置于55℃水浴中水解4ｈ冷至室溫后加pH10.8的碳酸鹽緩沖液0.5ml及乙醚5ml,渦旋2min,離心,分取上層有機相4ml置于經(jīng)硅烷化處理的帶尾管的雞心瓶中,加甲醇0.4ml,于40℃水浴中揮發(fā)至約0.1ml,進樣1μl進行GC分析9/25/2023133.樣品預處理----酶解及萃取

取檢尿1ml,加1

4.方法學評價

（1)選擇性:空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF標準液,經(jīng)酶解、萃取后進樣分析所得色譜圖表明尿中雜質(zhì)不干擾檢測.

（2)線性試驗:用空白尿配制不同濃度的LRZ標準液進行酶解、萃取、進樣分析,將LRZ與HEF色譜峰面積的比值與LRZ在尿液中的質(zhì)量濃度進行線性回歸,得到工作曲線方程:Y=3.1×10-3X–3.0×10-3,ｒ=0.998。LRZ在尿中的濃度為50～500μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性.9/25/2023144.方法學評價

（1)選擇性:空白尿1ml及空白尿1（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進行了多種溶劑萃取LRZ的研究,由經(jīng)萃取與未經(jīng)萃取所得色譜峰面積比計算LRZ的萃取率,得(mean±SD)為(83.4±3.1)%。

（4）檢出限:以3倍信噪比計算檢出限,得本法的檢出限為5μg/L。

（5)回收率:由工作曲線計算LRZ的質(zhì)量濃度及其回收率,得(mean±SD)為(103.3±5.1)%。

9/25/202315（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進行了多種溶劑萃取8/8/2

5.尿液檢測:志愿者口服LRZ2ｍｇ后,于32小時內(nèi)收集其排泄的尿液進行檢測,LRZ于9h達尿中最高濃度為444μｇ/L,檢測結(jié)果表明,本方法適合于麻醉后犯罪案件中ＬＲＺ的檢測要求。

返回9/25/202316

5.尿液檢測:志愿者口服LRZ2ｍｇ后,于32小時內(nèi)收集建立和發(fā)展快速而靈敏的分離和測定對映體藥物方法的重要性和必要性

①對某些手性藥物進行對映體的純度檢查；②生物體液中藥物對映體的分離分析研究可探索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系；③評價單個對映體的效價、毒性、不良反應以及藥動學性質(zhì)；④必要時，可進行手性藥物對映體的制備分離。二、手性藥物的高效液相色譜法

9/25/202317建立和發(fā)展快速而靈敏的分離和測定對映體藥物方法的重要性和必要（一）手性藥物拆分機理

為了使對映體轉(zhuǎn)化為化學和物理性質(zhì)不同的非對映體，就要提供一種手性源，使待拆分的對映異構(gòu)體（樣品）、手性作用物（如固定相）和手性源之間形成一個非對映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。在對映體拆分理論中頗為流行的是“三點手性識別模式”。

9/25/202318（一）手性藥物拆分機理

為了使對映體轉(zhuǎn)化為化

9/25/202319

8/8/202319（二）手性HPLC拆分法的類型

直接法：柱前手性衍生化法

間接法：手性流動相拆分法、手性固定相拆分法

1．柱前手性衍生化法：對映體混合物以手性試劑作柱前衍生化，形成非對映體，然后以常規(guī)（偶見手性）固定相分離。

對手性衍生化試劑的要求：高光學純度。

常用的手性衍生化試劑：羧酸衍生物類、胺類、異硫氰酸酯類、異氰酸酯類、萘衍生物類、光學活性氨基酸類、固相衍生化試劑。9/25/202320（二）手性HPLC拆分法的類型

直接法：柱前手性衍生化法

間

2．手性流動相拆分法（手性洗脫法或手性流動相添加劑法）：將手性試劑加入流動相中，手性添加劑與樣品形成手性絡(luò)合物。

常用的手性添加劑：配基交換型手性添加劑、環(huán)糊精類添加劑、手性離子對絡(luò)合劑9/25/202321

2．手性流動相拆分法（手性洗脫法或手性流動相添加劑法）：將3．手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動相添加劑）固著于多種基質(zhì)上而制成手性固定相。迄今為止，尚沒有一種通用型的手性柱，需要根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)來選擇合適的手性柱。

常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白質(zhì)類手性固定相、環(huán)糊精類手性固定相。

9/25/2023223．手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動相添加劑）固著（三）應用

1．對某些手性藥物進行對映體的純度檢查；

2．生物體液中藥物對映體的分離分析研究可探

索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系；

3．在研制手性藥物過程中，可分別評價單個對

映體的效價、毒性、不良反應、藥動學性質(zhì)；

4．必要時，可進行手性藥物對映體的制備分離

（或拆分）。9/25/202323（三）應用

1．對某些手性藥物進行對映體的純度檢查；

2．生

示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢查（柱前手性衍生化法）

手性衍生化試劑：乙酰葡萄糖異硫氰酸酯

色譜條件：色譜柱NOVA-PackC18（150mm×3.9mm）

流動相甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀（pH2.8）（51∶49）該法所用的手性衍生化試劑可以與一級胺、二級胺在溫和的條件下迅速反應，所生成的非對映體衍生物可以在普通色譜系統(tǒng)中進行分離分析。

9/25/202324示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢查（柱前手性衍生化法）

示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動相拆分法）

色譜條件：

色譜柱ZorbaxODS（250mm×4.6mm），

流動相含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸銅（CuSO4·5H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸調(diào)pH至3.0）-甲醇（9∶1）（流動相中L-苯丙氨酸及硫酸銅濃度分別為0.008mol/L和0.004mol/L）。

流動相中L-苯丙氨酸為配基交換型手性添加劑，硫酸銅為二價金屬螯離子，L-苯丙氨酸與銅離子螯合，分布于流動相中，遇到色氨酸對映體，共同形成配位絡(luò)合物對，然后在反相柱上拆分。

9/25/202325示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動相拆分法）

色譜條件：

示例三、克侖特羅對映體的拆分（手性固定相拆分法）

色譜條件：

色譜柱Chirex3005手性色譜柱

[（R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基

苯甲酸以共價鍵結(jié)合]

流動相正己烷-二氯乙烷-甲醇

該法的拆分機理為“三點手性識別模式”。

返回9/25/202326

示例三、克侖特羅對映體的拆分（手性固定相拆分法）

色譜條件三、毛細管電泳分析法（一）簡介1．高效2．高速3．微量4．低消耗（二）主要分離模式1．毛細管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移，產(chǎn)生泳流。9/25/202327三、毛細管電泳分析法8/8/2023272．膠束電動毛細管色譜（micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC）或MEKC）在緩沖液中加入離子型表面活性劑，形成膠束。被分離物質(zhì)在水和膠束兩相分配，各溶質(zhì)在因分配系數(shù)存在差別而被分離。3.毛細管凝膠電泳（capollarygelelectrophoresis,CGE）毛細管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應生成凝膠作支持物進行的電泳。9/25/2023282．膠束電動毛細管色譜（micellarelectroki4.毛細管等速電泳（capillaryisotachor-phoresis,CITP）采用前導電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細管中充入前導電解質(zhì)后，進樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個狹窄的區(qū)帶，然后依次通過檢測器。5.毛細管電色譜（capillaryelectrochromatography,CEC）將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲流驅(qū)動操作緩沖液進行分離。9/25/2023294.毛細管等速電泳（capillaryisotachor6.毛細管等電聚焦電泳（capillaryisoelectricfocusing,CIEF）將毛細管內(nèi)壁涂覆聚合物減少電滲流，再將供試品和兩性電解質(zhì)混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和堿液，施加壓力后毛細管中操作電解質(zhì)溶液逐步形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細管中遷移至各自的等電點時變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值得方法使溶質(zhì)通過檢測器。9/25/2023306.毛細管等電聚焦電泳（capillaryisoelec第二節(jié)藥物現(xiàn)代光譜法及其應用一、近紅外分光光度法（一）方法特點1．可獲得一系列的物理性質(zhì)的信息2．樣品無需預處理3．分析速度快3．毛細管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）4．毛細管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）（三）HPCE在藥物分析中的應用9/25/202331第二節(jié)藥物現(xiàn)代光譜法及其應用3．毛細4．靈敏度高5．運用范圍廣6．便于在線分析和控制（二）常見的NIR吸收波長及其結(jié)構(gòu)歸屬（三）應用1．鑒別2．純度檢查3．含量測定二、核磁共振光譜分析法（一）簡述（二）定量分析方法9/25/2023324．靈敏度高8/8/2023321．方法特點2．測定方法（三）應用示列1．鹽酸普魯卡因的結(jié)構(gòu)堅鑒定2．植物中藥及其偽品的區(qū)別3．亞硝酸戊酯（amylnitrite）及其吸入劑（amylnitriteinhalant）的含量測定（USP24）三、x射線粉末衍射法（一）x射線簡介（二）布拉格方程（三）x射線衍射儀的工作原理（四）應用9/25/2023331．方法特點8/8/202333第三節(jié)色譜聯(lián)用技術(shù)及其應用一、氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術(shù)（一）簡介（二）GC-FTIR系統(tǒng)組成與光譜檢索（三）應用示列二、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（一）簡述（二）色譜柱（三）接口9/25/202334第三節(jié)色譜聯(lián)用技術(shù)及其應用8/8/202334（四）定量分析方法1．總離子流色譜法2．質(zhì)量碎片圖質(zhì)譜法（五）應用示列1．固相萃取結(jié)合GC-MS系統(tǒng)分離生物體液中常見毒物藥物2．GC-MS測定冰片的川芎嗪血藥濃度三、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（一）概述9/25/202335（四）定量分析方法8/8/202335（二）接口裝置1．粒子束（particalbeam）接口2．熱噴霧（TSP）接口3．大氣壓離子化（API）接口4．動態(tài)快原子轟擊法（FAB）（三）應用示列1．區(qū)安奈德中特殊雜質(zhì)的檢查2．血樣和尿樣中秋水仙堿的LC-ISP-MS定性定量分析9/25/202336（二）接口裝置8/8/202336四、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)（一）方法特點（二）基本操作模式1．連續(xù)流動（on-flow）操作模式2．停流（stopflow）