酒餅分離出根霉的活力檢測方法

酒餅分離出根霉的活力檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆崭购Y選的原理和方法。了解保存的5株根霉的活力。實(shí)驗(yàn)原理1糖化力的測定糖化力是指1g干曲在30°C、pH值4.6的條件下，1h水解可溶性淀粉生成的葡萄糖的毫克數(shù)，計為mg/h?g-1,葡萄糖的生成量采用費(fèi)林熱滴定。其測定的基本原理為：淀粉水解所生成的葡萄糖等還原性糖，可在加熱及堿性條件下與費(fèi)林試劑中的二價銅離子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，還原糖中的半縮醛羥基被氧化，銅離子生成氧化亞銅的磚紅色沉淀。次甲基藍(lán)的氧化型為藍(lán)色，還原型為無色，當(dāng)以還原糖滴定費(fèi)林試劑時，由于次甲基藍(lán)氧化能力較二價銅弱，還原糖先與二價銅離子反應(yīng)，待二價銅全部被還原后，過量1滴還原糖將次甲基藍(lán)還原，溶液藍(lán)色消失以示終點(diǎn)。2液化力的測定液化力定義：1.0g干曲在30C作用1h能液化可溶性淀粉的毫克數(shù)表示，計為mg/h?g-1。用淀粉能與碘產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)的特性，試樣浸出液在30C，pH4.6溶液中酶解至試液對碘的藍(lán)紫色特征反應(yīng)消失。根據(jù)所需時間計算1g絕干曲在該條件下1h能液化淀粉的克數(shù)，表示液化力的大小。3根霉曲試飯實(shí)驗(yàn)原理利用微生物的生長發(fā)酵，將曲種接種到米飯中培養(yǎng)72h，24h后取其醪液測定其還原糖含量和總酸。還原糖采用費(fèi)林試劑法，試飯酸度采用氫氧化鈉滴定法。實(shí)驗(yàn)材料乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6)：稱取164g無水乙酸鈉(CH3COONa)，溶解于水，加114ml冰乙酸，用水稀釋至1000ml。緩沖溶液的pH應(yīng)以酸度計校正?？扇苄缘矸廴芤?20g/L)：稱取100C?105C干燥2h的可溶性淀粉2g，精確至0.001g，用水調(diào)成糊狀，不斷攪拌注入70ml沸水，攪拌煮沸2min直至完全透明，冷卻至室溫，完全轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中并定容。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液：取41ml甲液和4.5ml乙液混勻。甲液：稱取40.2349g氯化鉆，0.4878g重銘酸鉀，溶解后，蒸餾水定容至500ml。乙液：稱取0.04g銘黑T,溶解后，蒸餾水定容至100ml。碘液：稱取11.0g碘、22.0g碘化鉀，置于研缽中，加少量水研磨至碘完全溶解，用水稀釋定容至500ml，為原碘液，貯存于棕色瓶中。使用時，吸取2.0ml,加20.0g碘化鉀，用水溶解定容至500ml,為稀碘液，貯存于棕色瓶中。萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.5g/L):稱取經(jīng)103°C?105°C烘干至恒重的無水葡萄糖2.5g，精確至0.0001g，用水溶解，并定容至1000ml。此溶液需當(dāng)天配制。甲基藍(lán)指示劑(10g/L):稱取1.0g次甲基藍(lán)，加水溶解并定容至100ml。費(fèi)林甲液：稱取硫酸銅69.28g，加水溶解并定容至1000ml；費(fèi)林乙液：稱取酒石酸鉀鈉346g及氫氧化鈉100g，加水溶解并定容至1000ml，搖勻，過濾，備用；0.1mol/L氫氧化鈉溶液；大米：市售，要求新鮮有甜味，無沙石，米粒均勻；酒精計：標(biāo)準(zhǔn)溫度20C，分度值為0.2；酚酞指示液(10g/L)：稱取酚酞1g，溶于乙醇并稀釋至100mL；恒溫箱，天平，500mL三角瓶，150mL三角瓶，1000mL全玻璃蒸餾器，100mL量筒，堿式滴定管；培養(yǎng)箱；燒杯實(shí)驗(yàn)步驟1麩皮曲的制備稱取新鮮麩皮20g，加水12mL充分拌勻，潤料30min后，裝于500mL三角瓶中，塞好棉塞，121C滅菌30min，排氣降壓，待溫度降至30C，重復(fù)進(jìn)行二次滅菌30min。滅菌完畢，取出搖瓶打散。將分離得到的根霉斜面培養(yǎng)物分別接于三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，28C恒溫培養(yǎng)，大約到38-48h，三角瓶菌絲長滿培養(yǎng)基表面，部分菌絲倒伏時，進(jìn)行扣瓶(翻面)。在倒放翻面時，由于三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基結(jié)餅，手拍三角瓶底部，使餅塊離三角瓶內(nèi)底面約lcm高，在恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至72h。三角瓶菌種培養(yǎng)成熟，菌絲己長好，將三角瓶內(nèi)菌種倒入己消毒過的牛皮紙袋內(nèi)，搓散后放入恒溫箱內(nèi)40C通風(fēng)干燥12h，即得純種干曲。用封口袋包裝于4C冰箱保存?zhèn)溆谩?酶液抽提E稱取5.0g絕干重的粉碎曲樣，置于250ml三角瓶中，加水90ml和10ml、pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，搖勻，在30C浸泡1h(每隔15min攪拌1次)。用濾紙過濾，備用。3糖化力的測定E3.1糖化液的制備吸取20g/L可溶性淀粉溶液5ml，置于10ml比色管中，于30°C恒溫水浴中保溫10min。準(zhǔn)確加入1ml酶液，立刻計時，搖勻。在30C恒溫糖化1h。時間到達(dá)后，迅速加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液3ml，終止酶的作用。取出，冷卻，加水定容至刻度，搖勻。3.2空白液制備吸取20g/L可溶性淀粉5ml，置于10ml比色管中，先加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液3ml，然后準(zhǔn)確加入酶液1ml，立刻計時，搖勻。在30C恒溫糖化1h。取出，冷卻，加水定容至刻度，搖勻。3.3葡萄糖含量的測定3.3.1標(biāo)定費(fèi)林溶液的預(yù)滴定準(zhǔn)確吸取費(fèi)林甲、乙液各5ml于250ml錐形瓶中，加水30ml，混合后置于電爐上加熱至沸騰。滴入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，保持沸騰，待試液藍(lán)色即將消失時，加入次甲基藍(lán)指示液兩滴，繼續(xù)用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色剛好消失為終點(diǎn)，并記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積（V）。全部滴定操作應(yīng)在3min內(nèi)完成。3.3.2費(fèi)林溶液的標(biāo)定準(zhǔn)確吸取費(fèi)林甲、乙液各5ml于250ml錐形瓶中，加水30ml?；靹蚝螅尤氡阮A(yù)滴定體積（V）少2ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于電爐上加熱至沸，加入次甲基藍(lán)指示液兩滴，保持沸騰2min，繼續(xù)用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色剛好消失為終點(diǎn)，并記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積（V1）。全部滴定操作應(yīng)在3min內(nèi)完成。3.3.3試樣的測定吸取斐林溶液甲、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水30ml，準(zhǔn)確加入5ml糖化液。用滴定管加入適量的2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（使滴定時消耗2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1ml以內(nèi)）。在電爐上加熱至沸,。加2滴l%次甲基藍(lán)指示劑，并保持2min。繼續(xù)用2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色消失，記錄總消耗2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為V2,空白試驗(yàn)消耗2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為Vo,根據(jù)公式計算糖化力值（糖化力=（V0—V2）X2.5/5X10/1X100/5）。4液化力的測定[1]稱取5.0g絕干重的粉碎曲樣，加水90ml，加醋酸一醋酸鈉緩沖溶液10ml,在30°C浸泡1h（每隔15min攪拌1次）。用濾紙過濾，備用。取2滴預(yù)先配好的標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液于白瓷板空穴內(nèi)，作為比較顏色的標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)確吸取20g/L可溶性淀粉溶液5ml及水20ml于三角瓶中，置于30C恒溫水浴中保溫10min。準(zhǔn)確吸取酶液5ml于上述保溫淀粉溶液中，立刻計時，搖勻。以后定時取出液化液1滴于預(yù)先充滿稀碘液l滴的白瓷板空穴內(nèi)。當(dāng)顏色與標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色相同時，即為反應(yīng)終點(diǎn)，記錄所需時間t（min），并計算液化力值（液化力=60/tX0.1/0.25X1000）5純種根霉曲的試飯?jiān)囼?yàn)5.1試飯的制備[1]稱取秈米150g，裝入1000mL三角燒瓶中，按加水比（1g：1.0ml）加入應(yīng)加的水量，于103C高壓滅菌鍋中滅菌30min。要求飯重等于米和所加水量之和，不足部分可用冷開水補(bǔ)足。待涼至30C，拌入秈米重量0.3%的曲粉，28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。發(fā)酵39h開始測不同發(fā)酵時間的還原糖含量和總酸。在發(fā)酵完畢后，另取酒碚100g，加200mL蒸餾水，蒸餾，測定酒精度。5.2還原糖含量的測定取糖化飯10g于150ml三角瓶中，加蒸餾水50ml，0.1MPa壓力下殺菌10分鐘，迅速冷卻，過濾，濾液定容至500ml⑵。吸取斐林溶液甲、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水30ml，準(zhǔn)確加入5ml濾液。用滴定管加入適量的2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（使滴定時消耗2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1ml以內(nèi)）。在電爐上加熱至沸，并保持2min。加2滴l%次甲基藍(lán)指示劑。繼續(xù)用2.5g/L萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色消失，記錄總消耗2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為V3，空白試驗(yàn)消耗2.5g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V4。還原糖含量計算公式如下：還原糖含量=（V4-V3）X2.5/5X500/10*/1000*100）。5.3試飯酸度的測定取糖化飯10g于150ml三角瓶中，加蒸餾水50ml，0.1MPa壓力下殺菌10分鐘，迅速冷卻，過濾，濾液定容至500ml⑵。吸取試樣50mL于150mL燒杯中，加2滴10g/L酚酞指示液，用0.1moL/LNaOH溶液滴至微紅色為止，消耗0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（V5）即為試飯酸度。5.4酒精度的測定取酒碚100g