微生物菌種的篩選、誘變與保存技術(shù)PPT幻燈片

微生物菌種的保藏、篩選及誘變技術(shù)

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育實(shí)驗(yàn)4-2紫外線誘變育種實(shí)驗(yàn)4-3微生物菌種的保藏方法實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的蟲(chóng)體復(fù)壯實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)從含酚工業(yè)污水、活性污泥中篩選苯酚降解菌。

2.學(xué)習(xí)通過(guò)活性污泥馴化分離耐酚菌。二、實(shí)驗(yàn)原理酚類(lèi)化合物是化工、造紙、鋼鐵等工業(yè)廢水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死魚(yú)蝦、危害莊稼、嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，是各國(guó)研究關(guān)注的污染物之一。含酚廢水中分離出的生物降解酚能力強(qiáng)的菌為：假單胞菌、白乳桿菌、假絲酵母和野絲膜菌等。含酚廢水生物處理目前主要采用活性污泥法。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌源含酚工業(yè)廢水或含酚廢水曝氣池中的活性污泥。

2.培養(yǎng)基耐酚真菌培養(yǎng)基(固體、液體和斜面)，耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基(固體、液體和斜面)，碳源對(duì)照培養(yǎng)液a，苯酚培養(yǎng)液b，見(jiàn)附錄Ⅲ。

3.試劑2%4-氨基安替比林溶液，8%鐵氰化鉀溶液，氯仿，氨性氯化銨緩沖液，溴酸鉀-溴化鉀溶液，硫代硫酸鈉溶液,1%淀粉溶液，（見(jiàn)附錄Ⅴ）。

4.其他稀釋分離所用的無(wú)菌水，無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌移液管，測(cè)定酚所用的移液管，容量瓶，試劑瓶，酸式滴定管等。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育圖4-1梯度平板

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育涂布法分離：將采集的樣品按涂布法分離，30℃培養(yǎng)2天后，平板上生長(zhǎng)的菌落也形成密度梯度，苯酚低濃度區(qū)形成菌苔，苯酚高濃度區(qū)出現(xiàn)稀少菌落，將此菌落在含耐酚細(xì)菌或真菌培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線分離，最后挑取單菌落接種到耐酚斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2天。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育

3.耐酚菌馴化先將從含酚廢水采集的活性污泥放入含酚量小于l00mg/L含酚廢水中，添加0.3%MgSO4·7H2O、0.3%KH2PO4，30℃振蕩培養(yǎng)6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰對(duì)酚不適應(yīng)的微生物；再流加含酚廢水，使苯酚濃度增加至200mg/L，30℃振蕩培養(yǎng)4～6天；再提高到流加250mg/L含酚廢水，30℃培養(yǎng)4天，從中選出對(duì)酚耐受力強(qiáng)的菌株。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育

4.性能測(cè)定。初篩：制備不同含酚濃度的耐酚平板培養(yǎng)基，苯酚濃度為0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，將選出的耐酚力強(qiáng)的的菌株在以上平板培養(yǎng)基上劃線分離，自高酚濃度平板上長(zhǎng)出的菌落，即為酚降解力高的菌株。復(fù)篩：將初篩純化的菌種分別接入碳源對(duì)照培養(yǎng)液a和苯酚培養(yǎng)液b中，30℃振蕩培養(yǎng)48h，0、12、24、36、48h取樣測(cè)A600光密度值，繪制生長(zhǎng)曲線，以不含酚的碳源(葡萄糖)培養(yǎng)液為對(duì)照。若與對(duì)照相比，在250mg/L苯酚濃度培養(yǎng)液中生長(zhǎng)速度下降不明顯，同時(shí)，用4-氨基安替比林法檢測(cè)發(fā)酵初時(shí)發(fā)酵液和發(fā)酵終止時(shí)發(fā)酵液苯酚濃度，計(jì)算降解率，若苯酚降解率達(dá)>80%，表明確系分離到有效苯酚降解菌。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．記錄分離得到的苯酚降解菌情況于表4-1。

2．根據(jù)復(fù)篩耐酚試驗(yàn)，繪制對(duì)照組與試驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線。

3．記錄在平板上和顯微鏡下觀察的苯酚降解菌的菌落特征和鏡檢特征。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育表4-1苯酚降解菌株的降解率菌源菌株不同酚濃度平板生長(zhǎng)狀況0.025%0.045%0.060%0.075%菌源菌株苯酚降解率﹤70%71%～80%81%～90%91%～100%返回實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握紫外線誘發(fā)微生物突變的基本原理。

2．學(xué)習(xí)篩選、檢出和鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以紫外線作為誘變因素，照射時(shí)間為60s，用青霉素法將缺陷型進(jìn)行濃縮。再根據(jù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，只能在完全培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基中加有它所缺陷的那種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的原理，采用逐個(gè)點(diǎn)種法，將營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出，然后用生長(zhǎng)譜法將缺陷型加以鑒定。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種野生型大腸桿菌（E.coli）。

2.培養(yǎng)基肉湯液體培養(yǎng)基，加倍肉湯液體培養(yǎng)基(2E)，固體完全培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基(固體)，無(wú)N基本液體培養(yǎng)基，2N基本液體培養(yǎng)基，見(jiàn)附錄Ⅲ。

3.生長(zhǎng)因子類(lèi)別混合氨基酸和混合維生素的配制（若所用氨基酸為DL型，量需加倍），共分八組（見(jiàn)表4-2）.４.器材培養(yǎng)皿(9cm、6cm)，三角瓶(150mL)，lmL吸管，10mL吸管，離心管(10mL)，帶15W紫外燈管照射裝置，離心機(jī)等。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

表4-2混合氨基酸和混合維生素的配制I賴(lài)精甲硫半胱胱嘌II組精蘇谷天冬嘧Ⅲ丙甲硫蘇羥脯甘絲Ⅳ亮半胱價(jià)羥脯異亮纈Ⅴ苯丙胱天冬甘異亮酪Ⅵ色嘌嘧纈酪Ⅶ脯Ⅷ混合維生素（含多種常用維生素）實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.誘變處理（1）實(shí)驗(yàn)前14～16h挑取野生型大腸桿菌1環(huán)于盛有5mL肉湯的三角瓶中，置37℃培養(yǎng)過(guò)夜。（2）第2天添加5mL新鮮的肉湯培養(yǎng)液，充分混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)5h。（3）取5mL培養(yǎng)好的溶液倒入離心管中，離心(3500r/min，10min)。（4）倒去上清液，打勻沉淀，吸入5mL生理鹽水，制成菌懸液。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

（5）吸上述菌液3mL于直徑為6cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)(皿內(nèi)放一攪拌子，下為磁力攪拌器)，將培養(yǎng)皿放在15W的紫外光燈下，距離28.5cm。（6）處理前先開(kāi)紫外燈穩(wěn)定10min以上，將待處理的培養(yǎng)皿連蓋放入燈下滅菌lmin，然后開(kāi)蓋在攪拌條件下處理lmin，照射后蓋上皿蓋，再關(guān)紫外燈。（7）吸3mL加倍肉湯培養(yǎng)液倒入處理后的培養(yǎng)皿中，放置在37℃溫箱內(nèi)，避光培養(yǎng)12h以上。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

2.用青霉素法淘汰野生型（1）吸5mL處理過(guò)的菌液于已滅菌的離心管，離心10min(3500r/min)。（2）倒去上清液，打勻沉淀，加入生理鹽水，離心洗滌3次，吸生理鹽水到原體積。（3）吸取經(jīng)離心洗滌的菌液0.1mL于5mL無(wú)N基本培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)12h。（4）培養(yǎng)12h后，按1∶1加入2N基本培養(yǎng)液5mL，稱(chēng)取青霉素鈉鹽，使青霉素在菌液中的最終濃度約為500u/mL，再放入37℃溫箱中培養(yǎng)。（5）從培養(yǎng)12，16，24h的菌液中，各取0.1mL菌液到預(yù)先倒好的基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板中涂皿。放入37℃溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

3.缺陷型的檢出（1）以上平板培養(yǎng)36～48h后，進(jìn)行菌落計(jì)算，選用完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落數(shù)大大超過(guò)基本培養(yǎng)的那一組，用無(wú)菌牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落100個(gè)，分別點(diǎn)種于基本與完全培養(yǎng)基平板上，先基本后完全，于37℃溫箱培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)12h后，選在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)，完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，在基本培養(yǎng)基的平板上劃線復(fù)證。37℃溫箱培養(yǎng)，24h后不生長(zhǎng)的可能是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，便可用于鑒定。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

4.生長(zhǎng)譜鑒定（1）將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5mL肉湯培養(yǎng)液的離心管中，37℃培養(yǎng)14～16h。（2）培養(yǎng)16h后，以3500r/min離心l0min，倒去上清液，打勻沉淀，然后離心洗滌三次，最后加生理鹽水到原體積。（3）吸取經(jīng)離心洗滌的菌液lmL于滅菌的培養(yǎng)皿中，然后倒入熔化后冷至40～50℃的基本培養(yǎng)基，搖勻放平，待凝，共做兩皿。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

（4）將兩只培養(yǎng)皿的皿底，等分8格，依次放入混合氨基酸，混合維生素和核酸堿基混合物，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24～28h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程參見(jiàn)圖4-2。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告觀察生長(zhǎng)圈，確定是哪種營(yíng)養(yǎng)缺陷型。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

圖4-2紫外線誘變篩選大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株流程圖返回實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠⒄莆站N保藏的常用方法、基本原理及其應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理菌種保藏的原理是微生物在低溫、干燥、缺氧的條件下會(huì)降低代謝活動(dòng)，使細(xì)胞處于休眠和代謝停滯狀態(tài)，從而能夠較長(zhǎng)期地保藏菌種，并能推遲細(xì)胞退化，降低菌種的變異率。常用的保藏方法包括斜面?zhèn)鞔２胤?、穿刺保藏法、液體石蠟保藏法、砂土管保藏法等。這些方法操作簡(jiǎn)便易行，不需要特殊設(shè)備，為一般實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)單位廣泛采用。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌斜面菌種。

2.培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏1號(hào)培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。

3.試劑10%HCl，篩子，無(wú)水氯化鈣，醫(yī)用液體石蠟（比重0.83～0.89），河沙，瘦黃土（含有機(jī)物少的黃土）。

4.器材干燥器，40目及100目無(wú)菌篩子，無(wú)菌試管，無(wú)菌移液管（1mL及5mL），接種環(huán)，接種針，無(wú)菌滴管，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.砂土管保藏法此法僅適用于保藏產(chǎn)生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌或霉菌等。

(1)無(wú)菌砂土管制備①河砂處理取河砂1000～1500g，用40目篩子過(guò)篩，除去大的顆粒。再用10%HCl溶液浸泡，除去有機(jī)雜質(zhì)，鹽酸用量應(yīng)浸沒(méi)砂面，約浸泡24h，倒出鹽酸，用自來(lái)水沖洗至中性，烘干。用磁鐵石除去黃砂中的鐵質(zhì)。②篩土取30cm以下的較貧瘠非耕作層的黃土若干，自來(lái)水沖洗至中性，烘干磨細(xì)，用100目篩子過(guò)篩。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

③砂和土混合砂和土以1∶1或3∶2混合均勻，裝入100mm×10mm小試管中。裝量約1cm高即可，塞上棉塞，包上牛皮紙。④滅菌高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌1～1.5h。每天一次，連續(xù)滅3d。在50℃以下烘干。⑤無(wú)菌檢查取滅菌后的砂土少許，接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)1～2d，觀察有無(wú)雜菌生長(zhǎng)。如有，則需重新滅菌。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

（2）制備菌懸液首先使斜面菌體生長(zhǎng)健壯，孢子飽滿，吸取3～5mL無(wú)菌水至1支已培養(yǎng)待保藏的菌種斜面中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子或菌苔（注意不要帶入菌絲和培養(yǎng)基），使成菌懸液，細(xì)胞濃度為108～1010mL-1。（3）加樣用無(wú)菌吸管吸取菌懸液，在每支砂土管中滴加4～5滴菌懸液，用接種環(huán)拌勻，塞上砂土管棉塞。（4）干燥將已滴加菌懸液的砂土管置于干燥器內(nèi)。干燥器內(nèi)應(yīng)預(yù)先放置無(wú)水氯化鈣用于吸水。當(dāng)無(wú)水氯化鈣因吸水變成糊狀時(shí)則應(yīng)進(jìn)行更換。如此數(shù)次，砂土管即可干燥。有條件時(shí)，也可用真空泵連續(xù)抽氣約4h，即可達(dá)到干燥效果。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

（5）抽樣檢查從抽干水分的砂土管中，每10支抽取1支進(jìn)行檢查。用接種環(huán)取少許砂土，接種到適合于所保藏菌種生長(zhǎng)的斜面上，并進(jìn)行培養(yǎng)。檢查有無(wú)雜菌生長(zhǎng)及所保藏菌種的生長(zhǎng)情況。（6）保藏若經(jīng)檢查沒(méi)有發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，可將砂土管繼續(xù)放在干燥器內(nèi)（干燥器底部盛有硅膠、石灰或五氧化二磷等物），用橡皮塞或棉塞塞住試管口，并置于室溫或4℃冰箱保存。也可用真空泵抽干水分后火焰封口。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

2.斜面保藏方法（1）貼標(biāo)簽在標(biāo)簽紙上寫(xiě)明接種的細(xì)菌菌名、培養(yǎng)基名稱(chēng)和接種日期，貼在試管斜面正上方距離試管口2～3cm處。（2）斜面接種將待保藏的菌種用斜面接種法接種在已注明菌名的試管斜面上。（3）培養(yǎng)細(xì)菌置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24h，酵母菌置28～30℃恒溫箱中培養(yǎng)26～60h，放線菌和絲狀真菌置28℃培養(yǎng)4～7天。（4）保藏斜面長(zhǎng)好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。這種方法一般可保藏三個(gè)月至半年。

實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

3.液體石蠟保藏法（1）液體石蠟滅菌將液體石蠟置于100mL的小錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶裝10mL，塞上棉塞，外包牛皮紙，高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌30min。滅菌后將裝有液體石蠟錐形瓶置于105～110℃的烘箱內(nèi)約1h，以除去液體石蠟中的水分。（2）接種將菌種接種至適宜的斜面培養(yǎng)基上。（3）培養(yǎng)在適宜溫度條件下培養(yǎng)，使其充分生長(zhǎng)。（4）加液體石蠟用無(wú)菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入到已長(zhǎng)好菌的斜面上，液體石蠟的用量以高出斜面頂端1～2cm左右為宜，使菌種與空氣隔絕實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

（5）保藏將已注入液體石蠟的斜面培養(yǎng)物直立，置于4～5℃冰箱或室溫下保存。（6）轉(zhuǎn)接到保藏期后，需將菌種轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后再加入適量滅菌液體石蠟，進(jìn)行保藏。注意：從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄各種菌種保藏的方法和結(jié)果。返回實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的復(fù)壯

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)從病蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)壯病原菌的一般方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蘇云金桿菌及其變種殺螟桿菌、青蟲(chóng)菌和松毛蟲(chóng)桿菌等都是昆蟲(chóng)的致病細(xì)菌。將它們經(jīng)過(guò)固體或液體培養(yǎng)基大量培養(yǎng)后，可收集其菌體并添加適量的填充料如碳酸鈣等，以制成殺蟲(chóng)菌粉。它對(duì)玉米螟、稻苞蟲(chóng)、粘蟲(chóng)、松毛蟲(chóng)、棉鈴蟲(chóng)和菜青蟲(chóng)等幾十種鱗翅目昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)均具有很強(qiáng)的感染力。實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的復(fù)壯

生產(chǎn)菌種經(jīng)過(guò)若干代之后往往會(huì)出現(xiàn)菌種衰退，表現(xiàn)為產(chǎn)芽孢或伴孢晶體的數(shù)量越來(lái)越少，體積變小，毒力下降等。為了保證生產(chǎn)菌種能保持較強(qiáng)的毒力和原有的性狀，就要進(jìn)行經(jīng)常性的菌種復(fù)壯工作。對(duì)于殺蟲(chóng)菌來(lái)講，復(fù)壯就是用原來(lái)生產(chǎn)菌種制成懸浮液，然后將它拌到飼料中飼養(yǎng)昆蟲(chóng)(選健壯的3齡幼蟲(chóng))，待昆蟲(chóng)死后再?gòu)南x(chóng)體內(nèi)重新分離出蘇云金桿菌。如此重復(fù)4～8次即可得到毒力強(qiáng)的菌種。另外，也可從自然界死亡蟲(chóng)體中分離菌種。實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的復(fù)壯

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

2.器材顯微鏡，無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌三角瓶(內(nèi)裝玻璃珠)，鑷子，解剖針，無(wú)菌滴管等。

3.試劑75%乙醇，5.25%次氯酸鈉(即漂白粉)，10%硫代硫酸鈉。四、實(shí)驗(yàn)方法

1.制備菌液將菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)24h后，用無(wú)菌水洗下菌苔制成孢子懸液。實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的復(fù)壯

2.感染昆蟲(chóng)將上述菌液滴加在喂飼昆蟲(chóng)的葉片上，晾干后任昆蟲(chóng)(挑選健壯的3齡幼蟲(chóng))取食，然后將蟲(chóng)子放25℃恒溫條件下飼養(yǎng)，待昆蟲(chóng)死亡后采集死蟲(chóng)。

3.采集死蟲(chóng)瀕于死亡的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)停止取食后，口吐褐色體液，排泄稀糞于葉片或其他附著物上，部分或大部分的蟲(chóng)體開(kāi)始變?yōu)楹稚Ｓ捎诩?xì)菌在蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖，結(jié)果使幼蟲(chóng)的體壁變得薄而易破，因此采集時(shí)要特別小心。將采集來(lái)的昆蟲(chóng)放在無(wú)菌培養(yǎng)皿或無(wú)菌小瓶中。如果死蟲(chóng)緊貼在粘附物上可連同基物一起采集。實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的復(fù)壯

4.蟲(chóng)體表面消毒為防止消毒溶液滲入體腔，應(yīng)用棉線結(jié)扎蟲(chóng)體的口腔和肛門(mén)。將蟲(chóng)體浸入75%乙醇中，浸數(shù)秒鐘后即移入含5.25%漂白粉的溶液中，浸3～5min，再將蟲(chóng)體轉(zhuǎn)入10%硫代硫酸鈉溶液內(nèi)浸3～5min，以除去游離的氯，最后用無(wú)菌水沖洗蟲(chóng)體5次，供分離菌種用。

5.分離細(xì)菌把消毒好的幼蟲(chóng)置無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌條