基因工程的基本操作程序(上課)

專題1基因工程1.1

DNA重組技術(shù)的基本工具1.2基因工程的基本操作程序1.3基因工程的應(yīng)用1.4蛋白質(zhì)工程的崛起本節(jié)知識(shí)體系基因工程的基本操作程序：一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1.2基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1基因工程原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列，不能轉(zhuǎn)錄并不能編碼蛋白質(zhì)，但有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，如啟動(dòng)子、終止子等它山之石原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)RNA聚合酶的作用是催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。它能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。它山之石

RNA聚合酶是催化以DNA為模板（template）、三磷酸核糖核苷為底物、通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶。因?yàn)樵诩?xì)胞內(nèi)與基因DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為RNA有關(guān)，所以也稱轉(zhuǎn)錄酶。真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞基因編碼區(qū)（間隔、不連續(xù)）外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟動(dòng)子、終止子它山之石真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與原核細(xì)胞比較，真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)是：編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。也就是說，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列被不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列分隔開來，成為一種斷裂的形式。其中，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子，一般不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子。它山之石原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是連續(xù)的編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成的它山之石編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？思考？基因的種類（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。（2）沒有翻譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因。它山之石啟動(dòng)子與終止子

啟動(dòng)子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能引導(dǎo)RNA聚合酶與正確的基因部位結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄從起點(diǎn)開始，沿編碼區(qū)進(jìn)行。

終止子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。它山之石基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取新授

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體

限制酶

與表達(dá)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA

反轉(zhuǎn)錄受體菌群體

與表達(dá)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取cDNA為具有與某RNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA即complementaryDNA之縮寫某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入cDNA文庫(kù)基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因比較：部分基因文庫(kù)和基因組文庫(kù)原理：前提：過程：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列目的基因DNA受熱變性解鏈為單鏈；引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛞?、目的基因的獲取2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因由穆里斯等人于1988年發(fā)明，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR全稱為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction)反應(yīng)過程：1.變性：加熱至90～95℃目的基因DNA解鏈;2.復(fù)性：冷卻至55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈;3.延伸：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因動(dòng)畫演示PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制(PCR擴(kuò)增儀內(nèi))主要在細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子解旋酶、普通的DNA聚合酶等基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取3.人工合成：反轉(zhuǎn)錄法等基因比較小已知其核苷酸序列已知其mRNA

的序列已知其翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列

生物材料DNA目的基因的獲取mRNAcDNAPCR反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫(kù)DNA一定大小范圍的DNA基因組文庫(kù)人工合成限制酶切自然界中分離人工方法合成自然界分離后再人工合成歸納小結(jié)基因比較小，且已知核苷酸序列基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取

構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛞?、目的基因的獲取尋根問底深度思考為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建----基因工程的核心⑴使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給下一代⑵同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的2.基因表達(dá)載體的組成a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)它們各有什么作用？基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建----基因工程的核心2.基因表達(dá)載體的組成a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾部，起終止轉(zhuǎn)錄的作用為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來（如抗氨芐青霉素基因，綠色熒光基因）

它們各有什么作用？外來的編碼特定蛋白質(zhì)的基因DNA復(fù)制起點(diǎn)，即DNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)

⑴用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)兩個(gè)切口，露出____________。⑵用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建的步驟⑶將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_____處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。DNA分子基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建----基因工程的核心尋根問底深度思考作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，需要使用啟動(dòng)子和終止子才能比較有利于基因的表達(dá)。通過cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（2）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（3）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（4）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚨?、基因表達(dá)載體的構(gòu)建----基因工程的核心尋根問底深度思考將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，結(jié)果會(huì)怎樣？提示：有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物。此法目前爭(zhēng)議頗多，嚴(yán)格來講不算基因工程?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛉⒛康幕?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化—目的基因進(jìn)入

內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持

和

的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用80%）基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌感染特點(diǎn)：（2）轉(zhuǎn)化原理：基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

易感染雙子葉植物和裸子植物(對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力）。

當(dāng)植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，這時(shí)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（插入目的基因也可轉(zhuǎn)移）可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體DNA上。1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（3）轉(zhuǎn)化過程：基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)

根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理，你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？原因：根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導(dǎo)物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。尋根問底深度思考

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的其他方法：?jiǎn)巫尤~植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的其他方法：2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射技術(shù)（最常用、最有效）（2）轉(zhuǎn)化過程：基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞發(fā)育成新性狀動(dòng)物顯微注射取卵（受精卵）目的基因表達(dá)載體提純受精卵發(fā)育、移植3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）原核生物作受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)（2）轉(zhuǎn)化過程：基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。（應(yīng)用最為廣泛----大腸桿菌）受體細(xì)胞