放射免疫技術(shù)課件

第七章放射免疫技術(shù)第一節(jié)放射免疫技術(shù)一、原理及分類二、常用的放射性核素三、標(biāo)記物制備及鑒定四、抗血清鑒定第七章放射免疫技術(shù)第一節(jié)放射免疫技術(shù)1第二節(jié)放射免疫分析一、基本原理二、實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定第三節(jié)免疫放射分析一、基本原理二、IRMA與RIA的比較思考題小結(jié)第二節(jié)放射免疫分析思考題2免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對(duì)樣品中相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記技術(shù)：將可被探測(cè)的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。標(biāo)記免疫分析：用可微量或超微量檢測(cè)的示蹤劑標(biāo)記抗原、抗體，檢測(cè)免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。標(biāo)記免疫技術(shù)－基本概念免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對(duì)樣品中相應(yīng)抗原或抗體3常見標(biāo)記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)

常見標(biāo)記免疫技術(shù)4

第一節(jié)放射免疫技術(shù)

第一節(jié)放射免疫技術(shù)

5早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競爭性結(jié)合的免疫放射分析(IRMA)。該類技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析，對(duì)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起到了極大地推動(dòng)作用。

早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析(R6放射免疫RIA以標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測(cè)定待檢樣品中抗原量。

免疫放射IRMA以過量標(biāo)記抗體與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結(jié)合標(biāo)記抗體。放射受體分析RRA放射配體結(jié)合分析RBA其它一、放射免疫技術(shù)－原理及分類放射免疫免疫放射放射受體分析其它一、放射免疫技術(shù)－原理及分類7二、放射免疫技術(shù)－常用的放射性核素

125I

3H射線γβ理化性活潑差核素豐度>90%－半衰期60.2d12.3y標(biāo)記方法簡單復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備低廉昂貴測(cè)量條件簡單復(fù)雜常用標(biāo)記核素二、放射免疫技術(shù)－常用的放射性核素8125碘-標(biāo)記物的制備－標(biāo)記125I-化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放射性負(fù)電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。125I或125I+125I-標(biāo)記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應(yīng)直接標(biāo)記法三、放射免疫技術(shù)－標(biāo)記物制備及鑒定125碘-標(biāo)記物的制備－標(biāo)記125I-化學(xué)或酶促反應(yīng)，將129使用無還原劑的高比放射性碘源被標(biāo)記物用量要少ch-T用量要低控制總反應(yīng)體積<200μl反應(yīng)時(shí)間1-2分鐘弱堿性反應(yīng)條件使用無還原劑的高比放射性碘源10間接標(biāo)記法聯(lián)接標(biāo)記(bolton-Hunter)預(yù)先將125I用ch-T法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團(tuán)可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。bolton-Hunter間接標(biāo)記法聯(lián)接標(biāo)記(bolton-Hunter)預(yù)先將111125碘-標(biāo)記物的制備－純化凝膠過濾法離子交換層析法

聚丙烯酰胺凝膠電泳

高效液相色譜法聚合、損傷物標(biāo)記蛋白游離125I125碘-標(biāo)記物的制備－純化凝膠過濾法聚合、損傷物標(biāo)記蛋白12125碘-標(biāo)記物的制備－鑒定

標(biāo)記物質(zhì)量高比放射性高純度完整免疫活性

放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率應(yīng)大于95%

免疫活性標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比該值越大,標(biāo)記物免疫活性好125碘-標(biāo)記物的制備－鑒定標(biāo)記物質(zhì)量13

比放射單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度單位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性過高，將影響標(biāo)記物免疫活性計(jì)算法：依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）來計(jì)算標(biāo)記物的比放射性.自身置換法：比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測(cè)定標(biāo)記物的比放射性

結(jié)果準(zhǔn)，測(cè)定復(fù)雜比放射計(jì)算法：依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記14比放射性－計(jì)算法

結(jié)果欠準(zhǔn)，計(jì)算簡便比放射性－計(jì)算法結(jié)果欠準(zhǔn)，計(jì)算簡便15

自身置換曲線

反應(yīng)系統(tǒng)：限量Ab和遞增劑量(cpm)的標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原的結(jié)合率(B/T%)隨標(biāo)記抗原總量的增加而減少兩條曲線平行,若標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)品抗原具有相同的免疫活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

反應(yīng)系統(tǒng):抗體（限量）、標(biāo)記抗原（定量）和劑量遞增的標(biāo)準(zhǔn)抗原組成標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率(B/T%)隨標(biāo)準(zhǔn)抗原的增加而競爭抑制性減少自身置換曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線16比放射性－自身置換法

標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線平行表明在相同的放射性結(jié)合水平上，二實(shí)驗(yàn)中抗體上結(jié)合的抗原物質(zhì)總量相同計(jì)算置換曲線平行段某結(jié)合率的放射性強(qiáng)度(cpm/ml換算為nCi/ml)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線平行段相應(yīng)結(jié)合率對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗原化學(xué)量(ng/ml)以平行段多點(diǎn)結(jié)合率對(duì)應(yīng)的放射強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)抗原量進(jìn)行直線回歸，其斜率即為比放射性(nCi/ng)比放射性－自身置換法標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線平行17四、放射免疫技術(shù)－抗血清鑒定抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的結(jié)合強(qiáng)度用親和常數(shù)Ka表示。單位為稀度單位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度親和性親合力高親合力低四、放射免疫技術(shù)－抗血清鑒定抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合部親和性18放射免疫技術(shù)－抗血清鑒定特異性:指一種抗體識(shí)別相應(yīng)抗原決定簇的能力交叉反應(yīng)率：將反應(yīng)的最大結(jié)合率抑制下降50%時(shí)特異性抗原與類似物的劑量（ED50）之比抗體交叉反應(yīng)程度直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性特異性效價(jià)放射免疫技術(shù)－抗血清鑒定特異性:指一種抗體識(shí)別相應(yīng)抗原決定簇19五、方法學(xué)評(píng)價(jià)除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性之外，應(yīng)注意以下指標(biāo)：可靠性劑量-反應(yīng)曲線高劑量鉤狀效應(yīng)五、方法學(xué)評(píng)價(jià)除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、20第二節(jié)放射免疫分析第二節(jié)放射免疫分析21一、放射免疫分析－基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力一、放射免疫分析－基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)22Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點(diǎn)，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關(guān)系。

Ab限量，Ag*定量,23以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系－劑量反應(yīng)曲線注：T即是B與F的總和以未結(jié)合的Ag*為注：T即是B與F的總和24二、放射免疫分析－實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定抗原抗體反應(yīng)Ag*Ag反應(yīng)條件體積溫度時(shí)間pHAb(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)平衡非平衡一步法二步法二、放射免疫分析－實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定抗原抗體反應(yīng)Ag*Ag反應(yīng)條25分離結(jié)合、游離標(biāo)記物二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)分離結(jié)合、游離標(biāo)記物二抗體沉淀法PEG沉淀法PR試劑26測(cè)量、數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計(jì)數(shù)器測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)

計(jì)算參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)擬合注：T即是B與F的總和測(cè)量、數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)算參數(shù)擬合注：T即是B與F27第三節(jié)免疫放射分析第三節(jié)免疫放射分析28一、免疫放射分析－基本原理以過量125I標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng),用固相免疫吸附劑對(duì)B或F進(jìn)行分離，其靈敏度和可測(cè)范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單。一、免疫放射分析－基本原理以過量125I標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)29單位點(diǎn)IRMA先用過量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用固相抗原結(jié)合未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離,測(cè)定上清液的放射量單位點(diǎn)IRMA先用過量標(biāo)記抗體與30雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過量的標(biāo)記抗體與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標(biāo)記抗體，測(cè)固相上放射性。雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原結(jié)31二、IRMA與RIA比較二、IRMA與RIA比較32放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好,常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足,RIA將逐漸被取代。放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好,常用于各種331.放射免疫技術(shù)的核心是什么？2.制備放射性125I標(biāo)記物的基本原理是什么？有哪些方法？3.評(píng)價(jià)125I標(biāo)記物質(zhì)量的指標(biāo)有哪些？4.用于放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)滿足哪些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)？5.放免分析中標(biāo)記/未標(biāo)記抗原、抗體的用量特點(diǎn)及與免疫復(fù)合物的量變關(guān)系？6.反應(yīng)結(jié)束后，如何將免疫復(fù)合物與游離標(biāo)記物分離開？7.放射免疫分析實(shí)驗(yàn)中，如何確定待測(cè)抗原的含量？8.免疫放射分析與放射免疫分析的反應(yīng)原理有何不同？9.γ閃爍計(jì)數(shù)器記錄的信號(hào)即是放射核素的衰變嗎？10.靈敏度、特異性和測(cè)定范圍，免疫放射分析與放射免疫分析有何區(qū)別？思考題1.放射免疫技術(shù)的核心是什么？思考題34 放射免疫技術(shù)的基本