代謝工程-周奕騰改+試卷

11級真題試卷代謝工程:利用基因工程技術(shù),有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)展準(zhǔn)確的修飾、改造或擴(kuò)展、構(gòu)建的代謝途徑,以轉(zhuǎn)變生物體原有代謝特性,并與基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合,提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學(xué)。1,這兩種技術(shù)有助于代謝工程的分析方面蛋白質(zhì)工程,合成生物學(xué),有助于代謝工程的基因操作方面.三大代謝途徑：糖酵解EM、三羧酸循環(huán)TCA、磷酸戊糖途徑HM〕或稱PPP兩個應(yīng)用實(shí)例：A、添加物導(dǎo)致代謝途徑酶活加強(qiáng)：加維生素增加了磷酸果糖激酶活性和乳酸脫氫酶活性，增加了乳酸的生產(chǎn)B、參加葡萄糖酸鈣能促進(jìn)高6一磷酸葡萄糖脫氫酶和葡萄糖激酶的酶活力，促進(jìn)了肌苷的合成4、酶調(diào)整方式、反響調(diào)整方式：5、5、轉(zhuǎn)錄的功能單位。以及調(diào)整基因的整個DNA子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子等6、分支代謝調(diào)整途徑：同功酶調(diào)節(jié)：催化一樣反響，但酶分子構(gòu)造有差異；協(xié)同反響抑制：一個不能少；累積反響抑制：按比例累加，無協(xié)同效應(yīng)，無拮抗作用；D.增效反響抑制：1+1>2(末端產(chǎn)物Y和ZE1產(chǎn)物過量并不影響其他末端產(chǎn)物的形成。只有當(dāng)YZ同時過量，才能對E1制作用。)E.挨次反響抑制：按①→②→③挨次逐步抑制；F.聯(lián)合激活或抑制調(diào)整：途徑產(chǎn)物各自調(diào)整，同一中間產(chǎn)物；7、會計(jì)算累積反響抑制〔60%，20%，68%〕8、不同谷氨酸生產(chǎn)菌的兩大特征：α-酮戊二酸脫氫酶的缺乏;對生物素的需要(生物素缺陷型)9、代謝流(物流/通量)(flux)指流入代謝物經(jīng)該途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱鞒鑫锏乃俾省?0、代謝流分析(metabolicfluxanalysis)：又稱代謝通量分析，一種計(jì)算流經(jīng)各種途徑的通量的技術(shù)，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞支點(diǎn)的物流分布。11、代謝設(shè)計(jì)原理：提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流；擴(kuò)展代謝途徑；構(gòu)建的代謝途徑12、代謝工程爭論的根本程序：改進(jìn)靶點(diǎn)確實(shí)定；基因操作；效果分析13、基因操作：基因過量表達(dá)，基因敲除，異源基因?qū)?4、四大組學(xué)：基因組學(xué)與比較基因組學(xué)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；蛋白質(zhì)組學(xué)；代謝組學(xué)15、英文簡稱：LC：液相色譜；GC：氣相色譜；GC-MS：氣質(zhì)聯(lián)用儀；NMR：核磁共振；HPLC:高效液相色譜；CE：毛細(xì)管電泳；2-DE：雙向凝膠電泳；DIMS：直接注射質(zhì)譜；FT-IR：傅立葉轉(zhuǎn)換紅外色譜；IEF：等電聚焦；ESI—MS：電噴霧質(zhì)譜；RI：示差折光檢測法；UV：紫外檢測法；了解基因的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制和物種進(jìn)化過程的學(xué)科。16、代謝工程的根本爭論思路環(huán)。17得到的結(jié)論，統(tǒng)稱為代謝通量分析18、代謝通量計(jì)算〔入為+，出為—〕18、AX(t)=0假設(shè)方程數(shù)小于反響速率數(shù)目〔代謝通量假設(shè)方程數(shù)大于反響速率數(shù)目，稱為超定系統(tǒng)。19的途徑。20、設(shè)計(jì)育種以及發(fā)酵工藝掌握的的五字策略：“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”①進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞對碳源養(yǎng)分物質(zhì)的吸??；②通，使來自上游和各個注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；產(chǎn)物；④堵，消退或減弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑；⑤出，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。21的一些點(diǎn)〔代謝物。著終產(chǎn)物的得率，這些節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。著終產(chǎn)物的得率，這些節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的安排比：節(jié)點(diǎn)輸出途徑的代謝流的比值。22、柔性節(jié)點(diǎn)：假設(shè)流入每一分支的流量簡潔轉(zhuǎn)變以滿足需求，這樣的節(jié)點(diǎn)稱為柔性節(jié)點(diǎn)(flexiblenode)。剛性節(jié)點(diǎn)：假設(shè)一個節(jié)點(diǎn)的一個或多個分支的安排率被嚴(yán)密掌握，則稱該節(jié)點(diǎn)是強(qiáng)剛性的。半柔性〔弱剛性〕節(jié)點(diǎn)：假設(shè)在一個節(jié)點(diǎn)的流量安排，由它的一個分支的動力學(xué)占優(yōu)勢，則稱該節(jié)點(diǎn)是半柔性〔弱剛性〕節(jié)點(diǎn)。23、會推斷〔柔性節(jié)點(diǎn)，安排比可變，總量一樣。剛性節(jié)點(diǎn)安排比不變，比例一樣〕112剛性：減弱B11PB2P12柔性：減弱B11PB2,P假設(shè)節(jié)點(diǎn)1或節(jié)點(diǎn)2為剛性時，B1增大，P1增大，P2減小。分3種狀況增加的＞削減的，P增加的＜削減的，P增加的≈削減的，P24、13CMFA原理與方法：利用同位素標(biāo)記底物及NMR或GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜儀)分冗余能更加準(zhǔn)確地估算未知通量1)〔擬〕穩(wěn)態(tài)假設(shè)是MFA的重要前提。代謝穩(wěn)態(tài)和同位素平衡狀態(tài)標(biāo)記底物的選擇必需慎重考慮。要合理設(shè)計(jì)標(biāo)記底物組合方式以獲得最大通量信息。為降低試驗(yàn)中底物用量方面的花費(fèi)，生物反響器容積應(yīng)盡量小。但反響器容積太小系統(tǒng)的穩(wěn)定條件便很難到達(dá)。因此目前使用的生物反響器容積通常在300-1000mL。25、作為運(yùn)載體必需具備哪些條件？能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。具多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)展篩選。如抗菌素的抗性基因26、基因操作的根本步驟：1、目的基因的獵取；2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建；3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；4、目的基因的檢測與鑒定27、獵取目的基因的常用方法有哪些?〔1〕從基因文庫中獵取〔2〕PCR技術(shù)擴(kuò)增〔3〕人工合成。。目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因28、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒错懀且豁?xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。②原理：DNA復(fù)制③條件：基因的核苷酸序列、四種脫氧核苷酸、一對引物(做啟動子)、DNA聚合酶.前提條件：2^n〔n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)〕⑤結(jié)果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增。2PCR〔高溫〕〔低溫〕〔適溫〕延長30、同源重組〔英語：Homologousrecombination〕是遺傳重組的一種類型，指兩股具有相像序列的DNA的重排列，使遺傳物質(zhì)發(fā)生交換?？砂l(fā)生于自然界中，或應(yīng)用于人工的分子生物學(xué)技術(shù)。31、非同源重組又包括位點(diǎn)專一重組和格外規(guī)重組。32、生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化。論述題1、以大腸桿菌為宿主構(gòu)建乙醇代謝工程生產(chǎn)菌和以釀酒酵母為宿主構(gòu)建乙醇代謝工程生產(chǎn)菌各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？大腸桿菌優(yōu)點(diǎn)：1〕底物譜寬，可以在廉價培育基上生長，含有木糖代謝基因，可以利用木糖〔2〕高密度培育，生長速率快；大腸桿菌的生理和遺傳背景清楚，有利于簡單遺傳操作。在好氧和無氧條件下均能產(chǎn)生乙醇?！病炒x副產(chǎn)物簡單，比方產(chǎn)生乙酸等副產(chǎn)物〔2〕對產(chǎn)物乙醇的耐受力量低，不利于積存高濃度乙醇。酵母優(yōu)點(diǎn)：厭氧生產(chǎn)乙醇時，代謝副產(chǎn)物少，對乙醇的耐受力量高，有利于積存高濃度乙醇。適合高密度培育。缺點(diǎn)：底物譜不夠?qū)?，常用的釀酒酵母以糧食為原料，高產(chǎn)乙醇但是不能利用木糖，也就不困難：把其它菌的木糖異構(gòu)酶基因?qū)氲结劸平湍福确紼.coliB.subtilis的木糖異構(gòu)酶基因，但都沒有成功，有肯定難度。2、谷氨酸棒桿菌中色氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)整機(jī)制如圖3所示。試述色氨酸工程菌株的代謝設(shè)計(jì)策略。圖3 谷氨酸棒桿菌中色氨酸生物合成途徑及其代謝調(diào)整機(jī)制〔代謝途徑描述：谷氨酸棒桿菌中色氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)整機(jī)制如下圖。在谷氨酸棒桿菌EMP途徑和HMP途徑分別生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)4-磷酸赤蘚糖(EP)，兩者在DAHP合成酶(DS)3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP經(jīng)三步酶促反響生成莽草酸，莽草酸經(jīng)三步酶促反響生成分支酸。由(AS)催化下合成鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸在鄰氨基苯甲酸磷酸核糖移換酶(PRT)、色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸變位酶(CM)的催化下生成預(yù)苯酸(PPA)。由(PD)酪氨酸；在預(yù)苯酸脫水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最終合成苯丙氨酸。在分支酸〕〔1〕加速限速反響PEP和EP的支路代謝，解除苯丙氨酸和酪氨酸對DS的反響調(diào)整，增加分支酸的濃度等方法。為了積存更多的PEP丙酮酸激酶活力低的菌株或者選育硫辛酸和硫胺素(分別為丙酮酸脫羧酶系和丙酮酸羧化酶系的輔酶)雙重缺陷突變株。將編碼限速酶的基因通過基因擴(kuò)增，增加拷貝數(shù)拷貝數(shù)的載體上再導(dǎo)入宿主中去表達(dá)DS酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA等。trpE、trpD、trpC、trpB、trpA這五種構(gòu)造基因集中在DNA將與色氨酸合成有關(guān)的基因克隆到質(zhì)粒pDTS9901BPS-13,在500ml培育基中3035.2g/〔親株產(chǎn)20.1g/。爭論覺察，假設(shè)使大腸桿菌中色氨酸操縱子中的弱化子缺失，則trp基因表達(dá)量可提高六倍，而且無論是在阻遏細(xì)胞內(nèi)還是在永久性突變的細(xì)胞內(nèi)都是這樣〔即無論trpR或trpR會提高色氨酸的產(chǎn)量。轉(zhuǎn)變分支代謝途徑流向提高代謝分支點(diǎn)某一分支代謝途徑的酶活力酸和苯丙氨酸三條支路上的任何一條支路的酶活性被加強(qiáng)DS基因克隆到谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamiu中，構(gòu)建精彩氨酸工程菌，它促使了Trp支路第一個產(chǎn)物氨茴酸AntTrp對該質(zhì)粒所編碼的Ant合成酶和Ant磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的反響抑制，結(jié)果色氨酸產(chǎn)量達(dá)43g/L。假設(shè)再將苯丙氨酸合成相關(guān)的酶基因如pheA基因敲除，則可使色氨酸產(chǎn)生菌產(chǎn)酸達(dá)50g/L。另外，切斷由分支酸到預(yù)苯酸、VK、CoQ的代謝支路，可節(jié)約碳源，使中間產(chǎn)物分支酸更多地DS而有利于色氨酸積存。具體可承受構(gòu)建預(yù)苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、酪氨酸缺陷、VK缺陷、CoQ缺陷等代謝改造措施。據(jù)報(bào)道，有人以谷氨酸棒桿菌為動身菌株，經(jīng)代謝改造得到的KY9456(Phe-+Tyr-)L-0.15g/L。這個產(chǎn)量是很低的，由此也可看出只構(gòu)建缺陷型是不夠的，還必需解除由色氨酸引起的反響調(diào)整。AS酶缺陷的回復(fù)突變株，可增加色氨酸的積存。由于當(dāng)