細胞轉染技術

細胞轉染技術編輯ppt一：轉染的簡介二：轉染的分類三：轉染的方法編輯ppt一、轉染的簡介1.基因轉染:將具生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能。2.基因轉染技術已廣泛應用于基因組功能研究和基因治療研究。編輯ppt二、轉染的分類瞬時轉染穩(wěn)定轉染目的快速分析為獲得穩(wěn)定表達外源基因的單細胞克隆目的DNA與宿主染色體未整合整合表達持續(xù)時間隨細胞分裂而稀釋至丟失48－72小時隨宿主細胞本身基因組一樣復制，轉錄，翻譯，并被穩(wěn)定遺傳篩選辦法抗生素抗性抗生素抗性編輯ppt基因轉染真核細胞的方法轉染方法化學轉染法物理轉染法病毒感染法DEAE一葡聚糖法顯微注射法逆轉錄病毒磷酸鈣法電穿孔法腺病毒人工脂質體法基因槍法編輯ppt

是最早應用哺乳動物細胞轉染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽離子多聚體,它與帶負電的核酸結合后接近細胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉染已成功地應用于瞬時開始，但用于穩(wěn)定轉染卻不可靠。DEAE-葡聚糖法

編輯ppt磷酸鈣共沉淀轉染法由于試劑易得、價格廉價而被廣泛用于瞬時轉染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上，通過胞膜的內吞作用攝人DNA。編輯ppt脂質體介導法〔目前應用最廣泛〕原理：陽離子脂質體試劑與DNA混合后，形成一種穩(wěn)定的脂質雙層復合物，DNA被包在脂質體中間，這種脂質雙層復合物可直接加到培養(yǎng)的細胞中，脂質體粘附到細胞外表并與細胞膜融合，DNA被釋放到胞漿中。編輯ppt此圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。編輯ppt【主要應用】:瞬時轉染穩(wěn)定轉染.【特點】：使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉染各種類型的細胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉染中有很高的效率，但在體內，能被血清去除，并在肺組織內累積，誘發(fā)強烈的抗炎反響，導致高水平的毒性，很大程度上應用受限制。編輯ppt利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的適宜轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

編輯ppt物理方法(電穿孔、顯微注射及基因槍)〔1〕電穿孔法利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進人的微孔。電穿孔技術可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染，可方便地用于懸浮細胞，重現性好，但需要較多的細胞。影響轉染效率的主要因素是脈沖強度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞的最正確平衡點。編輯ppt(2〕顯微注射法該法雖然費力，但卻是非常有效的將核酸導人細胞或細胞核的方法。這種方法常用來制備轉基因動物，但不適用于需要大量轉染細胞的研究。〔3〕基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導人細胞內，這種方法適用于培養(yǎng)的細胞和在體的細胞。編輯ppt實驗室用到的轉染方法脂質體介導法編輯ppt細胞轉染Lipofectamine2000轉染試劑：以HEK193細胞為例：轉染前一天，將細胞鋪到培養(yǎng)皿中，參加有血清無雙抗的培養(yǎng)基〔15ml〕；24小時候換上無血清無雙抗的培養(yǎng)基12ml；將所需的質粒用1.5ml無血清無雙抗的培養(yǎng)基稀釋；取40ul的Lipofectamine2000參加無血清無雙抗的培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5min；5min后將質粒和Lipofectamine2000混合在一起，室溫放置20min后參加培養(yǎng)皿中，4h后換上完全培養(yǎng)基48h培養(yǎng)；注：24h看一次，如果培養(yǎng)基變顏色換培養(yǎng)基；編輯ppt轉染的影響因素編輯ppt

細胞〔1〕分裂細胞相比較非分裂細胞〔2〕貼壁細胞相比較懸浮細胞〔3〕傳代次數〔4〕細胞數量〔融合率〕編輯ppt2交叉污染如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴格的別離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標培養(yǎng)物。編輯ppt3載體DNA對純化所得的載體進行質量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在測定細胞體系的參數時，一定要選用一種具有功能的載體做對照?！?〕載體完整性〔