中國(guó)藥典2023年版9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

202091019101分析方法驗(yàn)證〔analyticalmethodvalidation〕的目的是證明建立的方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、變更藥品生產(chǎn)工藝和制劑組分、修訂原分析方法時(shí)，需對(duì)分析方法進(jìn)展驗(yàn)證。生物制品質(zhì)量掌握中承受的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測(cè)定方法，其中理化分析方法的驗(yàn)證原則與化學(xué)藥品根本一樣，所以可參照本指導(dǎo)原則進(jìn)展，但在進(jìn)展具體驗(yàn)證時(shí)還需要結(jié)合生物制品的特點(diǎn)考慮；相對(duì)于理化分析方法而言，生物學(xué)測(cè)定方法存在更多的影響因素，因此本指導(dǎo)原則不涉及生物學(xué)測(cè)定方法驗(yàn)證的內(nèi)容。驗(yàn)證的分析工程：鑒別試驗(yàn)、雜質(zhì)檢查〔限度或定量分析〕、含量測(cè)定〔包括特性參數(shù)和含量/效價(jià)測(cè)定，其中特性參數(shù)如：藥物溶出度、釋放度等〕。驗(yàn)證的指標(biāo)有：專屬性、準(zhǔn)確度、周密度〔包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性〕、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍、耐用性。在分析方法中，須用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)展試驗(yàn)。由于分析方法具有各自的特點(diǎn)中，并隨分析對(duì)象而變化，因此需要視具體狀況擬訂驗(yàn)證的指標(biāo)。表1列出的分析工程和相應(yīng)的驗(yàn)證指標(biāo)可供參考。1工程內(nèi)容鑒別雜質(zhì)測(cè)定含量測(cè)定-特性參數(shù)-含量或效價(jià)測(cè)定定量限度專屬性②++++準(zhǔn)確度-+-+周密度重復(fù)性-+-+中間周密度-+①-+①檢測(cè)限〔LOD〕--③+-定量限(LOQ)-+--線性-+-+范圍-+-+耐用性++++1已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需要驗(yàn)證中間周密度；23視具體狀況予以驗(yàn)證。方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容如下：一、專屬性專屬性系指在其他成分〔如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等〕可能存在下，承受的分析方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的力量。鑒別反響、雜質(zhì)檢査和含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)承受一種或多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。鑒別反響應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或構(gòu)造相像的化合物。不含被測(cè)成分的供試品，以及構(gòu)造相像或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反響。含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定承受的色譜法和其他分別方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說(shuō)明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置，色譜法中的分別度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)比照品可獲得的狀況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可參加雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中參加肯定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分別。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的狀況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)展測(cè)定，與另一個(gè)閱歷證的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照耀、高溫、高濕、酸〔堿〕水解或氧化的方法進(jìn)展強(qiáng)制破壞，以爭(zhēng)論可能的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響。含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢査應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可承受光電二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)展峰純度檢查。二、準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度系指用所建立方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收率〔%〕表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)試驗(yàn)。準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的周密度、專屬性推算出來(lái)。在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度〔相當(dāng)于 100%濃度水平〕的供試品，用至少6份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)展評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)展測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)展評(píng)價(jià)，且濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。兩種方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍?；瘜W(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度原料藥可用純度的比照品或供試品進(jìn)展測(cè)定，或用所測(cè)定結(jié)果與準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)展比較。制劑可在處方量空白輔料中，參加量被測(cè)物比照品進(jìn)展測(cè)定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中參加量的被測(cè)物進(jìn)展測(cè)定，或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)展比較?；瘜W(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度可向原料藥或制劑中參加量雜質(zhì)比照品進(jìn)展測(cè)定。如不能得到雜質(zhì)比照品，可用所建立的方法與另一成熟的方法〔如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法〕的測(cè)定結(jié)果進(jìn)展比較。中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度可用純度的比照品進(jìn)展加樣回收率測(cè)定，即向被測(cè)成分含量的供試品中再周密參加肯定量的純度的被測(cè)成分比照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以參加比照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須留意比照品的參加量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必需在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；參加的比照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對(duì)誤差，過大則干擾成分相對(duì)削減，真實(shí)性差。數(shù)據(jù)要求對(duì)于化學(xué)藥應(yīng)報(bào)告參加量的回收率〔%〕，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間〔置信度一般為95%〕于中藥應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、比照品參加量、測(cè)定結(jié)果和回收率〔%〕計(jì)算值，以及回收率〔%〕的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差〔RSD%〕或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度關(guān)系可參考表2。在基質(zhì)簡(jiǎn)單、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。表2樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度待測(cè)定成分含量待測(cè)定成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)回收率限度〔%〕〔%〕〔ppm或ppb〕〔mg/g或μg/g〕〔g/g〕100–1000mg/g1.098～10110100000ppm100mg/g0.195～102110000ppm10mg/g0.0192～1050.11000ppm1mg/g0.00190～1080.01100ppm100μg/g0.000185～1100.00110ppm10μg/g0.0000180～1150.00011ppm1μg/g0.00000175～12010ppb0.01μg/g0.0000000170～125 *此表源自 AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validationof ChemicalMethodsforDietarySupplementsandBotanicals》。三、周密度周密度系指在規(guī)定的測(cè)定條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)屢次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。周密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在一樣條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的周密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)試驗(yàn)室內(nèi)的條件轉(zhuǎn)變、不同分析人員、不同設(shè)備測(cè)等測(cè)定結(jié)果之間的周密度，稱為中間周密度；在不同試驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果之間的周密度，稱為重現(xiàn)性。含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的周密度。1.重復(fù)性在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度〔分析方法擬定的樣品測(cè)定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平〕的供試品，用至少6份的測(cè)定結(jié)果進(jìn)展評(píng)價(jià)；或3備至少3份供試品溶液進(jìn)展測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。承受至少9份測(cè)定結(jié)果進(jìn)展評(píng)價(jià)時(shí)，濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。2.中間周密度考察隨機(jī)變動(dòng)因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)周密度的影響，應(yīng)進(jìn)展中間周密度試驗(yàn)。3.重現(xiàn)性國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)承受的分析方法，應(yīng)進(jìn)展重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過不同試驗(yàn)室協(xié)同檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)所用樣品質(zhì)量的全都性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對(duì)該全都性的影響，以免影響重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果。4.數(shù)據(jù)要求均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和周密度RSD可承受范圍參考表3〔可承受范圍可在給出數(shù)值0.5～2倍區(qū)間，計(jì)算公式，重復(fù)性：RSDr=C-0.15；重現(xiàn)性：RSDR=2C-0.15，其中C〕。在基質(zhì)簡(jiǎn)單、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，周密度限度可適當(dāng)放寬。3待測(cè)定成分含量待測(cè)定成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)性〔RSDr%〕重現(xiàn)性〔RSDR%〕〔%〕〔ppm或ppb〕〔mg/gμg/g〕〔g/g〕100–1000mg/g 1.012 10100000ppm100mg/g0.1 1.53110000ppm10mg/g0.0124 0.11000ppm1mg/g0.001360.01100ppm100μg/g0.0001480.00110ppm10μg/g0.000016110.00011ppm1μg/g0.00000181610ppb0.01μg/g0.000000011532 * 此 表 源 自 AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validationof ChemicalMethodsforDietarySupplementsandBotanicals》。四、檢測(cè)限檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。常用的方法如下。1.直觀法用濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被牢靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。2.信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)展比較，計(jì)算出能被牢靠地檢測(cè)出的被測(cè)3:1或時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。3.基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法依據(jù)LOD=3.3δ/S公式計(jì)算。式中LOD：檢測(cè)限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可以通過以下方法測(cè)得：〔1〕測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；〔2〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。4.數(shù)據(jù)要求上述計(jì)算方法獲得的檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)展驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說(shuō)明試驗(yàn)過程和檢測(cè)限結(jié)果。五、定量限定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和周密度要求。對(duì)微量或痕量藥物分析、定量測(cè)定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。直觀法用濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被牢靠地定量測(cè)定的最低濃度或量。信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)展比較，計(jì)算出能被牢靠地定量的被測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限?；陧憫?yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法依據(jù)LOQ=10δ/S公式計(jì)算。式中LOQ：定量限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可以通過以下方法測(cè)得：〔1〕測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；〔2〕承受標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)要求上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)展驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和周密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。六、線性線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，線性試驗(yàn)結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈比例關(guān)系的力量。應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎猛槐日掌焚A備液經(jīng)周密稀釋，或分別周密稱取比照品，制備一系列比照品溶液的方法進(jìn)展測(cè)定，至少制備5種不同濃度水平。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀看是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)展線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)展線性回歸計(jì)算?；蛘呖沙惺苊枋鰸舛?響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、殘差平方和、線性圖〔或其它數(shù)學(xué)模型〕。七、范圍范圍系指分析方法能到達(dá)周密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的凹凸限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)依據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、周密度結(jié)果和要求確定。原料藥和制劑含量測(cè)定，范圍一般為測(cè)定濃度的 80%～120%；制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測(cè)定濃度的70%～130%,特別劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的－ 20%至上限的＋20%；雜質(zhì)測(cè)定，范圍應(yīng)依據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。假設(shè)一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)展含量測(cè)定與純度檢查，且僅使用100%的比照品，線性范圍應(yīng)掩蓋雜質(zhì)的報(bào)告水平至規(guī)定含量的120%。在中藥分析中，范圍應(yīng)依據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、周密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特別成效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%。八、耐用性耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)供