海洋綠藻的發(fā)酵液培養(yǎng)

海洋綠藻的發(fā)酵液培養(yǎng)

海洋微藻具有很好的生化和合成過程中的脂肪酸（uf），因此，它被用作新的非-3ufas[20.5（n-3）、epa、22.6（n-3）、鋯等新來源。微藻可作為浮游動物(輪蟲,枝角類等),甲殼類,雙殼類和幼齡魚類的餌料而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。對許多海產(chǎn)動物來說,餌料中含有豐富的PUFAs,尤其是EPA和DHA是魚蝦類生長所必需的脂肪酸(EFA),能夠提高其生長率和幼體的存活率,對人類心血管系統(tǒng)疾病有防治的效果。海洋微藻的脂肪含量和脂肪酸組成因藻種不同而異,不同的培養(yǎng)條件也會對其產(chǎn)生影響。國內(nèi)外對海洋綠藻的脂肪酸研究主要集中在小球藻屬Chlorella、微綠球藻屬Nannochloris、四片藻屬Tetraselmis、杜氏藻屬Dunaliella,而對其他屬藻株的脂肪酸組成則研究的較少。本文對11個屬海洋綠藻的30個藻株的總脂含量和脂肪酸組成進行了測定。1材料和方法1.1藻macc/c9工藝非小藻macc/c39-5sp/c9-自適應(yīng)雙亞藻macc/c33-5c3.5.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.3.30株海洋綠藻藻種均取自青島海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(MACC)Chlorellaautotuophica自養(yǎng)小球藻MACC/C3Chlorellavulgaris普通小球藻MACC/C7Chlorellasp.小球藻MACC/C57,/C65,/C95,/C97,/C102,/C103,/C104Chlorosarcinopsishalophilia綠囊藻MACC/C9Nannochlorismaculata微綠球藻MACC/C10Nannochlorisoculata眼點微綠藻MACC/C12,/C14Halochlorococcummarinum海綠球藻MACC/C8Halochlorococcumsarcotum海綠球藻MACC/C11Oocystismimuta卵胞藻MACC/C16Protococcussp.原球藻MACC/C17Brachiomonassubmarina咸胞藻MACC/C21Dunaliellabioculata雙眼杜氏藻MACC/C33Dunaliellaparva巴氏杜氏藻MACC/C35Dunaliellasalina鹽生杜氏藻MACC/C39,/C42,/C43Dunaliellasp.杜氏藻MACC/C44,MACC/C45,MACC/C46Stichococcusbacillar桿狀裂絲藻MACC/C19,/C20pyramimonassp.塔胞藻MACC/C53Chlamydomonassp.衣藻MACC/C301.2f/2培養(yǎng)液組對30株綠藻在5L細(xì)口玻璃瓶進行一次性培養(yǎng)。海水經(jīng)脫脂棉過濾,以自來水稀釋至鹽度為28,全部采用f/2培養(yǎng)液,室溫20℃±1℃,光照5000lx(日光燈),連續(xù)充氣。培養(yǎng)過程中每天用血球計數(shù)板計數(shù)。1.3微藻收獲微藻在指數(shù)生長末期離心收獲,收集的藻泥經(jīng)真空干燥后放入帶塞試管中,充N2氣-40℃保存。1.4藻粉中脂肪的測定采用索氏抽提法:稱取100mg左右藻粉,用濾紙包裹,于索氏抽提器中用乙醚抽提2h后洗凈接收瓶(接收瓶預(yù)先在80℃烘干至恒重,并稱重)外壁,80℃烘12h,冷卻后稱重,由此求出藻粉中脂肪的含量。1.5hp540型氣相色譜法按Volkman等的方法將脂肪酸甲酯化,然后用美國惠普公司HP5890Ⅱ型氣相色譜儀進行分析,色譜柱為毛細(xì)管柱,型號QUADREX,007-CW-30-0.25F。2結(jié)果與討論2.1g/l30株海洋綠藻按1.2的條件培養(yǎng)養(yǎng)7~10d,收獲藻細(xì)胞,收獲密度(cellsmL-1)和樣品的干重(g/L)以及總脂含量見表1。30株海洋綠藻收獲時的最終密度為1.07~81.36×106cells/mL,最高為C97(81.36×106cells/mL),最低為C42(1.07×106cells/mL)。干重0.12~0.46gL-1,最高為C102(0.46g/L)。最低為C43(0.12g/L)海洋微藻的脂肪含量遠(yuǎn)高于海洋大型藻類(僅為干重的1%左右),所測的30株海洋綠藻總脂含量大部分都比較高,為干重的4.52%~34.49%。其中9株小球藻(C3、C7、C57、C65、C95、C97、C102、C103、C104)總脂含量為8.06%~32.72%。李荷芳等測定的兩株富含EPA的小球藻(Chorellasp-1,Chlorellasp-2)的總脂含量為12.97%、15.97%、,說明不同株小球藻的總脂含量是有差別的。8株杜氏藻(C33、C35、C39、C42、C43、C44、C45、C46)的總脂含量為7.14%~29.91%,,李荷芳測定的一株杜氏藻(Dunaliellasp.)的總脂含量為30.00%。3株微綠球藻(C10、C12、C14)的總脂含量為8.02%~20.65%,2株裂絲藻(C19、C20)的總脂含量為12.94%、11.61%,2株海綠球藻(C8、C11)為34.49%、22.02%。綠囊藻(C9)為8.54%,卵胞藻(C16)為28.44%,原球藻(C17)為4.52%,咸胞藻(C21)為14.45%,衣藻(C30)為28.88%,塔胞藻(C53)的總脂含量為5.92%(表1)。2.2海洋藻類脂肪酸的組成表22.2.1脂肪酸組成和含量9株小球藻(C3,C7,C57,C65,C95,C97,C102,C103,C104)中,C95和C97的EPA(20∶5n-3)含量最高,分別占總脂肪酸的20.8%和26.1%。其他7株含量較低或不含。C95和C97與其它7株的主要脂肪酸組成有所不同,除16∶0含量接近外,C95和C97的主要脂肪酸為16∶1(n-7)(高達20%以上),20∶5(n-3)(高達20%以上)和一定量的20∶4(n-6)(4%以上),與李荷芳等報道的兩株富含EPA的小球藻的主要脂肪酸組成相似。其它7株小球藻則18∶1(n-9)含量特別高,達20~30%,18∶2(n-6)的含量也較高,達到10%~20%;一般不含20∶4(n-6),16∶1(n-7)含量也很少;另外16∶4(n-3)和18∶3(n-3)的含量也較高。C104,C57,C97和C102出現(xiàn)了少量的18∶5(n-3),C3,C7,C103,C104和C95均含少量的DHA(22∶6n-3)。由于20∶4(n-6)可以進一步飽和轉(zhuǎn)變?yōu)?0∶5(n-3),所以C95和C97可以通過優(yōu)化培養(yǎng)條件進一步提高EPA含量,Watanabe等就報道了一種海水小球藻(Chlorellasp.)含有高達30%的20∶5(n-3)。2.2.2脂肪酸組成分析8株杜氏藻(C33,C35,C39,C43,C44,C45,C42,C46)有著典型的杜氏藻脂肪酸特征,主要脂肪酸為16∶0,16∶4(n-3)和18∶3(n-3)。16∶4(n-3)的含量一般在10~30%之間,18∶3(n-3)的含量在20%左右,與Renaud等報道的Dunaliellasalina及李荷芳報道的Dunaliellasp.的脂肪酸組成相似。杜氏藻的突出特點是18∶3(n-3)的含量較高。8株杜氏藻中除C45外均有一定含量的18∶5(n-3)。其中C39的脂肪酸組成與其他7株略有不同,含有少量的C20PUFAs成分,主要是20∶2(n-6)和20∶4(n-6)。8株杜氏藻都含有少量的EPA(0.2%~0.83%),C39還含有微量的DHA(0.3%)。2.2.3脂肪酸組成及營養(yǎng)價值3株微綠球藻(C10,C12,C14)有著高含量的18∶3(n-3)脂肪酸(分別為25.1%,13.0%,15.3%)和18∶4(n-3)脂肪酸(分別為17.3%,6.7%,2.4%)。它們的主要脂肪酸為16∶0,16∶3(n-3),18∶2(n-6),18∶3(n-3)和18∶4(n-3),且EPA的含量都不高,而一些文獻中報道微綠球藻有著高EPA含量。綠囊藻C9的主要脂肪酸為16∶0,16∶4(n-3),18∶2(n-6),18∶3(n-3)和少量的C20PUFAs,海綠球藻C11和C8的主要脂肪酸為16∶0,18∶2(n-6),18∶3(n-3),18∶4(n-3)。卵胞藻C16的主要脂肪酸組成為16∶0,18∶2(n-6),18∶3(n-3)。原球藻C17的主要脂肪酸是16∶0,18∶1(n-9),18∶2(n-6),出現(xiàn)一種不常見的22∶5(n-3),含量為1.0%。咸胞藻C21的主要脂肪酸為16∶0,18∶2(n-6),18∶3(n-3)。裂絲藻C19,C20含有一定量的20∶5(n-3),分別為6.9%和8.1%;其主要脂肪酸為16∶0,16∶1(n-7),20∶5(n-3)。塔形藻C53的主要脂肪酸組成為16∶0,18∶1(n-9),18∶3(n-3),其PUFAs含量較少,為17.7%。衣藻C30的主要脂肪酸16∶0,16∶1(n-7),22∶2(n-6),22∶4。30株海洋綠藻有著典型的綠藻的脂肪酸組成,C16和C18PUFAs最為豐富,具體的主要脂肪酸又因種而異。C16PUFAs包括16∶2(n-6),16∶3(n-3)和16∶4(n-3),可能來自C18PUFAs的長鏈縮短或16∶1(n-9)的逐步去飽和。C18PUFAs主要包括18∶2(n-6),18∶3(n-3)和18∶4(n-3)。小球藻C95和C97的EPA(20∶5n-3)含量最高(分別為20.8%和26.1%),并含DHA(20∶6n-3)。另外一株小球藻C102和兩株裂絲藻C19和C20的EPA含量居中,分別為8.0%,6.9%和8.1%。其余藻種一般只含少量的EPA和DHA或不含。這說明綠藻一般僅含有少量的C20和C22PUFA或完全缺乏