蓖麻粗毒的提取及其藥效成分和藥效研究

蓖麻粗毒的提取及其藥效成分和藥效研究

氨基乙醇鈉對所有哺乳動物的真核細(xì)胞都有毒性作用，ld50為7,10）g，kg。在防治草原鼠害中具有較好的應(yīng)用前景。我們于2005～2006年對蓖麻粗毒的分離、提取及活性進(jìn)行了初步實驗研究。1實驗動物及試劑蓖麻籽為市售,去殼后4℃保存;實驗用昆明種小白鼠(體重20g左右)由四川大學(xué)實驗動物中心提供;勻漿機、冷凍離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、真空干燥器、1ml注射器、蒸餾水、透析袋均購自四川大學(xué)設(shè)備處;(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4等均為國產(chǎn)分析純。2單次給藥、細(xì)注射參考Nicolson等的方法,對提取條件進(jìn)一步研究,以小鼠是否死亡為指示,尋找提取蓖麻粗毒的最優(yōu)途徑。小鼠活性實驗設(shè)計:①對浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對應(yīng)的浸提液浸泡24h。分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對應(yīng)的粗毒溶液;②對鹽析后的混合物10000r/min離心30min,保留沉淀,取上清液。以上述浸提和鹽析兩種方式獲得的溶液做原藥,分別取1ml稀釋后腹腔注射小鼠(劑量為每鼠0.5ml),每組每濃度用5只小鼠,并取1只小鼠做空白對照。以小鼠死亡率最低的那組即是粗毒提取效果最佳的。每一實驗重復(fù)3次。2.1實驗a：提取物的選擇和提取物條件的討論2.1.1方法勻漿和浸提液制備分別稱取50g脫殼蓖麻籽,依次分別用100ml的水、100ml0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)和100ml5%乙酸溶液進(jìn)行勻漿,再靜置于4℃環(huán)境中浸提24h。對浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對應(yīng)的浸提液浸泡24h后,分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對應(yīng)的粗毒溶液作小鼠活性實驗。合成條件2、48h分別稱取50g脫殼蓖麻籽,用上述3種的浸提劑100ml勻漿,于4℃浸提12、24、36、48h。對浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對應(yīng)的浸提液浸泡24h后,分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對應(yīng)的粗毒溶液作小鼠活性實驗。各浸提劑最佳浸提時間的確定分別稱取50g脫殼蓖麻籽,加入100ml、150ml、200ml的上述3種的浸提劑勻漿。于4℃浸提至各種浸提劑對應(yīng)具有最佳蓖麻粗毒浸提效果的時間。對浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對應(yīng)的浸提液浸泡24h后,分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對應(yīng)的粗毒溶液作小鼠活性實驗。清液鹽析濃縮法分別稱取50g脫殼蓖麻籽,各自加入適量的浸提劑勻漿,4℃浸提適宜時間。所得混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂以及離心所剩的渣滓,保留清液,在清液鹽析24h后,10000r/min離心30min,收集沉淀,沉淀溶解于蒸餾水中,透析24h,將透析所得40℃減壓蒸餾,最后真空干燥可得蓖麻粗毒。從而可計算各自的產(chǎn)率。2.1.2結(jié)果與分析緩沖液的浸提效果結(jié)果表明,0.2mol/L的磷酸緩沖液的浸提后再次浸泡提取液的殺鼠效果最低,說明0.2mol/L的磷酸緩沖液的浸提效果最好(表1)。最佳浸提時間的確定由于選擇3種不同的浸提劑,故按照浸提劑分組,組內(nèi)進(jìn)行實驗最后綜合對比得出結(jié)果。同時最終只選擇3個濃度梯度的藥物做活性實驗。顯然,水做浸提劑時浸提36h的殺鼠效果最低,說明此時水已經(jīng)把絕大多數(shù)的蓖麻毒素浸提出來,導(dǎo)致渣滓里的蓖麻毒素含量很低,所以再次浸提后的殺鼠效果最低,從而說明36h是水的最佳浸提時間(表2);5%乙酸浸提劑浸提24h的殺鼠效果較低,浸提36h后的殺鼠效果區(qū)別很小,故24h是5%乙酸做浸提劑時的最佳時間(表3);0.2mol/L的磷酸緩沖液浸提24h的殺鼠效果較低,浸提36h后的殺鼠效果區(qū)別很小,同理,24h是0.2mol/L的磷酸緩沖液做浸提劑時的最佳時間(表4)。最佳質(zhì)量體積比的確定由于選擇3種浸提劑,故按照浸提劑分組,組內(nèi)進(jìn)行實驗最后綜合對比得出結(jié)果。同時基于方便的考慮,只選擇3個濃度梯度的藥物做活性實驗。結(jié)果表明,水做浸提劑時,蓖麻籽與水的質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)時,再次浸泡提取液的殺鼠效果較低,說明質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)的效果較好,同理1∶4時的效果最好,但是由于加入的浸提液越多,最終加入的鹽析劑就越多,而且1∶4浸提時的滅鼠效果并無顯著提高,所以出于經(jīng)濟方便的考慮,選擇1∶3為最佳質(zhì)量體積比(表5);5%乙酸做浸提劑時,蓖麻籽與5%乙酸的質(zhì)量體積比為1∶2(g/ml)時,再次浸提液的殺鼠效果最低,說明質(zhì)量體積比為1∶2(g/ml)的效果最好(表6);0.2mol/L的磷酸緩沖液做浸提劑時,質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)時,再次浸泡提取液的殺鼠效果最低,說明質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)的效果較好,同理1∶4時的效果最好,但是由于加入的浸提液越多,最終加入的鹽析劑就越多,而且1∶4浸提時的滅鼠效果并無顯著提高,出于經(jīng)濟方便的考慮,所以選擇1∶3為最佳質(zhì)量體積比(表6)。出于經(jīng)濟和方便的考慮,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),確定pH7.2左右可作為最適合浸提,在此不再討論。最佳浸提劑的確定由結(jié)果不難看出,只有0.2mol/L的磷酸緩沖液在同樣條件下所得蓖麻毒素(粗毒)產(chǎn)率最高(表8),同時提取路線還兼顧到蛋白的穩(wěn)定性及經(jīng)濟性,正是要尋找的最佳浸提劑。2.2實驗b：鹽析劑的選擇和最佳鹽析條件的探索2.2.1不同鹽析劑對小鼠的鹽析活性實驗稱取50g脫殼蓖麻仔,加入150ml0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.2)勻漿,4℃浸提24h。所得混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂以及離心所剩的渣滓,保留清液,在清液中分別加入不同的鹽析劑,每種鹽析劑分別加到50%、60%、70%、80%飽和度,鹽析24h后,10000r/min離心30min,觀察現(xiàn)象,收集沉淀,然后對所得的每種上清液取1ml,稀釋1000倍,做小鼠活性實驗,最終小鼠未死亡或死亡最少的那組即是鹽析效果最佳的。2.2.2結(jié)果與分析從表9可知,80%飽和度的(NH4)2SO4鹽析后的上清液殺鼠效果最低,說明80%飽和度的(NH4)2SO4鹽析效果最好。2.3實驗c：確定厚毒有用程度2.3.1ld50的制備稱取50g脫殼蓖麻仔,加入150ml0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.2)勻漿,4℃浸提24h。所得混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂以及離心所剩的渣滓,保留清液,在清液中加入(NH4)2SO4到80%飽和度,鹽析24h后,10000r/min離心30min,收集沉淀,然后對所得的沉淀用蒸餾水透析24h。將透析所得40℃減壓蒸餾,最后真空干燥可得粗毒。稱取一定量的粗毒,溶于100ml水中煮沸。放涼后取1ml以10倍稀釋法配制腹腔注射用藥,做小鼠活性實驗。用未煮沸的粗毒做活性實驗,可求得LD50。小鼠隨機分為5組,每組5只,按低比稀釋法配制不同劑量的藥液,每組分別給藥,記錄注射劑量、小鼠死亡時間,共觀察96h。LD50計算方法為寇氏法。2.3.2糖液毒蛋白的急性毒性實驗結(jié)果結(jié)果蓖麻粗毒制成水劑后煮沸,其中毒蛋白(含血球凝集素)被破壞,注射藥劑中有效成分僅為蓖麻堿和變應(yīng)原,蓖麻堿的毒性較弱,變應(yīng)原無致死作用。由實驗結(jié)果看出毒蛋白遭破壞后的殺鼠性能顯然比未被破壞的對照組要低得多,而血球凝集素的毒性僅為蓖麻毒蛋白的1/10(表10)。從而說明蓖麻粗毒的主要藥效成分為蓖麻毒蛋白。求得LD50=7.971μg/kg,S=0.0548μg/kgLD50的95%平均可信限為7.971±1.281μg/kg3投毒投毒試驗2006年3月中旬,在四川省阿壩州若爾蓋縣熱爾鄉(xiāng)進(jìn)行了野外滅鼠試驗。當(dāng)?shù)仄骄０?500m,氣溫-3～10℃。滅鼠對象主要為高原鼠兔。將蓖麻粗毒制成的滅鼠劑用水稀釋后拌取餌料,以餌料重量計配成1%濃度的毒餌,人工投餌,在5萬畝投餌區(qū)內(nèi)隨機劃定6個半徑為28.2m的圓形樣方,樣方間隔在50m以上,并設(shè)2個清水對照。投藥前調(diào)查樣方內(nèi)的有效洞數(shù),方法為堵洞盜洞法。投毒后6天檢查有效洞數(shù),計算滅效,結(jié)果如表12。大面積實驗的校正滅效為85.41%,實驗區(qū)內(nèi)高原鼠兔活動明顯減小,滅殺效果比較明顯。4實驗結(jié)果與分析實驗以滅鼠為目的,對蓖麻毒素(粗毒)的提取路線進(jìn)行優(yōu)化選擇,研究了提取粗毒的殺鼠活性,并進(jìn)行了大面積野外滅鼠試驗。結(jié)果表明,使用優(yōu)選的蓖麻毒素提取方法,