流加培養(yǎng)對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

流加培養(yǎng)對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

小球藻是綠藻門的一種細(xì)胞藻類。它含有許多營(yíng)養(yǎng)成分，如糖、養(yǎng)分、脂肪酸等。具有多種保健和藥理作用。小球藻糖具有抗腫脹、抗毒、抗血郁、增強(qiáng)身體免疫功能等作用。通過(guò)處理和破壁處理后，小球藻可以直接生產(chǎn)小型浮藻片、小球藻?；蛐∏蛟迥z囊。它適用于預(yù)防和輔助治療高血壓、高血糖、動(dòng)脈硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、慢性潰瘍、免疫功能低等疾病。它也可以用來(lái)開(kāi)發(fā)具有更高成本的精細(xì)化工產(chǎn)品和藥物產(chǎn)品，如生產(chǎn)綠葉、橘氨酸、油脂等。該藥物產(chǎn)品的提取可以提取到醫(yī)藥產(chǎn)品中。此外，小球藻也可以用于環(huán)保處理。與人形成一個(gè)循環(huán)系統(tǒng)。人們稱出的co可用于小球藻的生長(zhǎng)，而從小球藻產(chǎn)生的o2可用于人體呼吸。小球藻在航空航天中具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。要更好地利用小球藻,首先要獲得大量的小球藻藻體,本研究通過(guò)優(yōu)化小球藻培養(yǎng)條件來(lái)提高小球藻生物量,為其進(jìn)一步的擴(kuò)大培養(yǎng)提供依據(jù).1材料和方法1.1藻類和機(jī)器1.1.1藻類的來(lái)源小球藻(Chlorellaspp)藻種由煙臺(tái)大學(xué)海洋生化研究所提供.1.1.2儀器HZQ-QG振蕩箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠).1.2小球藻的生長(zhǎng)1.2.3生物量的測(cè)定用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).1.2.4實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基在f/2培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化.1.2.5土壤浸出液的制備首先取沒(méi)有施化肥或農(nóng)藥的土壤在三角瓶(1L)底部鋪上1cm厚的土層,隨后加入1L蒸餾水,高壓滅菌30min后,靜置24h,傾出上清液即可使用.1.2.6培養(yǎng)條件23℃,光強(qiáng)為4.5×103lx,轉(zhuǎn)速為140r/min下培養(yǎng)1.2.7正交試驗(yàn)優(yōu)化小球藻培養(yǎng)鹽小球藻生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)元素有15～20種,天然水體的大多數(shù)元素都能滿足它的需要,不會(huì)成為限制性因子.C、N、P是小球藻生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)元素.小球藻營(yíng)光自養(yǎng)生長(zhǎng),可直接利用空氣中的CO2.CO2主要以HCO3-的形式被利用.因此HCO3-鹽可直接作為小球藻生長(zhǎng)的碳源ue001.氮是生物最重要的營(yíng)養(yǎng)成分,而硝酸鹽一直是培養(yǎng)小球藻的一種普通氮源.培養(yǎng)基的pH是影響藻類有關(guān)生長(zhǎng)代謝等許多生理過(guò)程的另一重要因子.本實(shí)驗(yàn)利用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中NaHCO3、NaNO3和KH2PO4的濃度及小球藻生長(zhǎng)適宜的pH,采用L9(34)正交表進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。如表1所示.2結(jié)果與討論2.1氮源和磷源水平對(duì)小球藻生長(zhǎng)量的影響按表1設(shè)計(jì)的因素水平在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如表2所示.由表2可知,第5組實(shí)驗(yàn)小球藻長(zhǎng)勢(shì)最好,且當(dāng)pH值在6～7之間時(shí)小球藻生長(zhǎng)情況較好,pH值為5時(shí),小球藻的生長(zhǎng)明顯較差;當(dāng)碳酸氫鈉濃度小于0.10g/L時(shí),小球藻生物量隨碳酸氫鈉濃度的增加而增加,但超過(guò)0.10g/L時(shí),小球藻的生物量又隨之下降;隨著氮源水平的升高小球藻生長(zhǎng)量逐步升高,說(shuō)明氮源水平取得不夠,需作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);小球藻生長(zhǎng)量隨磷源水平的升高而逐步下降,說(shuō)明磷源水平取得過(guò)高,應(yīng)取較低的水平繼續(xù)實(shí)驗(yàn).總之,通過(guò)分析可知,較好的水平組合為A2B2C3D1,比較四因素的極差R知,影響小球藻生長(zhǎng)的因素的主次順序?yàn)锳>C>D>B,說(shuō)明pH值對(duì)它的影響最大,其次是氮源濃度.為了對(duì)氮源和磷源水平作進(jìn)一步的探索,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如表3所示,結(jié)果見(jiàn)表4.由表4可知,小球藻的生物量隨NaNO3濃度的增加而下降,故培養(yǎng)基中NaNO3最適濃度為0.225g/L;小球藻的生物量隨KH2PO4濃度的減少而下降,故培養(yǎng)基中KH2PO4最適濃度為0.005g/L.小球藻能利用光合作用將二氧化碳、水和無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)物.二氧化碳主要以HCO3-形式被利用,pH是影響培養(yǎng)基中HCO3-在總?cè)芙鉅顟B(tài)的CO2所占比例的主要因素,此外,pH值也會(huì)影響光合作用,并影響培養(yǎng)基中藻細(xì)胞對(duì)離子的吸收和利用,以及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生.因此,pH是影響小球藻生長(zhǎng)的重要因素,與正交試驗(yàn)的結(jié)果相符.2.2維生素的添加量對(duì)小球藻生物量的影響維生素是最早發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子,它們?cè)谛∏蛟迳L(zhǎng)過(guò)程中所起的作用主要是作為酶的輔基或輔酶參與新陳代謝.在已優(yōu)化好營(yíng)養(yǎng)鹽和pH值的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)考察維生素需求量.在配好的培養(yǎng)基中按體積分?jǐn)?shù)添加混合維生素量0.10%、0.13%、0.16%、0.20%,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn),小球藻的生物量先是隨著維生素添加量的增加而增加,當(dāng)維生素添加量超過(guò)0.16%時(shí),小球藻的生物量反而會(huì)下降,由此可知,培養(yǎng)基中維生素的添加量以0.13%～0.16%為宜.2.3光合對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響小球藻進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)會(huì)利用CO2放出O2,培養(yǎng)基中通入大量的無(wú)菌空氣既可為活細(xì)胞提供碳源,而且會(huì)把抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)的O2排出,同時(shí)又有助于保持藻細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)并促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞表面.但通氣量過(guò)大可能會(huì)損傷或殺死一些敏感細(xì)胞,應(yīng)保持較小的通氣量,并且通氣管道和過(guò)濾器都需無(wú)菌.培養(yǎng)條件:500mL培養(yǎng)基中添加1.5×106/mL的藻種于4.5×103lx下培養(yǎng)14d,通氣量水平取為:0,0.5,1.0,1.5,2L/min,結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出,小球藻在通氣量為1.5mL/min時(shí),生物量最大.當(dāng)光照到培養(yǎng)液表面時(shí),藻體本身對(duì)光有遮擋作用,故入射光穿透培養(yǎng)液時(shí)存在著不斷衰減的現(xiàn)象,且隨著培養(yǎng)密度的增加,這種光衰減現(xiàn)象會(huì)不斷加重,因此增加通氣量會(huì)加強(qiáng)培養(yǎng)液的混合,使小球藻每一個(gè)細(xì)胞接受光照的機(jī)會(huì)均等.但過(guò)強(qiáng)的通氣使之對(duì)細(xì)胞的剪切力加大,反而不利于小球藻的生長(zhǎng).2.4光飽和效應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)于營(yíng)光合自養(yǎng)生活的小球藻而言,光是藻生長(zhǎng)的重要限制因素.當(dāng)溫度和營(yíng)養(yǎng)不限制其生長(zhǎng)時(shí),光就成為影響小球藻自養(yǎng)生長(zhǎng)的主要因素,即藻的生物量是光照的函數(shù).一般情況下,在一定光照范圍內(nèi)藻的光合作用效率會(huì)隨光照度的增加而增加,但光照度達(dá)到一定值時(shí),光合作用效率幾乎保持在一定水平,不再增加,這種現(xiàn)象稱為光飽和效應(yīng).如果光照度超過(guò)光飽和點(diǎn)一定限度后,藻的光合作用效率將會(huì)下降,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至死亡,即光抑制現(xiàn)象.在光飽和點(diǎn)以下的光照度是藻生長(zhǎng)的一個(gè)限制性因子ue001.光強(qiáng)取2.0×103,3.3×103,4.5×103,5.5×103lx進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示.由圖3可看出,光強(qiáng)為4.5×103lx時(shí)小球藻生長(zhǎng)最好.光合作用由光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個(gè)過(guò)程組成,當(dāng)暗反應(yīng)所需的中間產(chǎn)物不能從光反應(yīng)中得到充分滿足時(shí),整個(gè)過(guò)程的速率完全取決于光反應(yīng)的速率,即隨著光強(qiáng)的增加光合作用加強(qiáng),小球藻的生長(zhǎng)較快;若光反應(yīng)形成了大量中間產(chǎn)物,而暗反應(yīng)速率已配合不上光反應(yīng)的速率,此時(shí)光合作用的整體速率將只取決于暗反應(yīng)的大小,同時(shí)由于光照強(qiáng)度太強(qiáng),會(huì)導(dǎo)致光合色素的光氧化和細(xì)胞中的某些酶受到氧化傷害而使光合作用速率下降,因而存在一個(gè)適宜的光照強(qiáng)度.2.5尿素用量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響氮是生物最重要的營(yíng)養(yǎng)成分,硝酸鹽一直是培養(yǎng)小球藻的一種普通氮源,但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),由于硝酸鹽的消耗會(huì)使培養(yǎng)基的pH變化較大.有研究表明,在藻類的生長(zhǎng)過(guò)程中消耗等量的氮,以尿素作氮源則比硝酸鹽產(chǎn)生出較多的生物量,并引起培養(yǎng)基較小的pH之變化,因此添加尿素作為有機(jī)氮源考查其對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響.尿素濃度取為0,0.30,0.60,0.90g/L,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如圖4所示.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿素是一種很好的有機(jī)氮源,并且在小球藻的培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)基中pH一直非常穩(wěn)定,當(dāng)尿素濃度為0.30g/L時(shí)小球藻生長(zhǎng)最好,而濃度為0.90g/L時(shí)則明顯不如對(duì)照組長(zhǎng)得好,說(shuō)明氮源量如果太多反而會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng).2.6土壤浸出液對(duì)小球藻生長(zhǎng)量的影響土壤浸出液往往含有一些含碳,氮,磷的有機(jī)物,無(wú)機(jī)鹽和微量元素。這些成分有可能成為小球藻生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分.在將營(yíng)養(yǎng)鹽及pH優(yōu)化好了的培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)分別為:0,0.2%,0.4%,0.6%的土壤浸出液,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),結(jié)果如圖5所示.由圖5可看出,添加土壤浸出液后,小球藻的生長(zhǎng)量明顯高于未添加的,且添加量在0.4%為最好.3小球藻培養(yǎng)基的配方確定pH是影響小球藻生長(zhǎng)的重要因素.光照強(qiáng)度和通氣量通過(guò)影響小球藻光合作用強(qiáng)度而影響小球藻的生長(zhǎng).小