植物硝酸還原酶(NR)活力測定(活體法)

植物硝酸還原酶（NR）活力測定（活體法）一、原理硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對–氨基苯磺酸（或?qū)ΘC氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下：生成的紅色偶氮化合物在540nm波長下有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1為單位。NR的測定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好二、儀器與用具分光光度計；真空抽氣泵（或20ml注射器筒）；天平；單面刀片；保溫箱（或恒溫水?。?；刻度試管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。三、試劑1.亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液

稱取分析純NaNO20.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀釋定容至1000ml，即為每ml含NaNO25μg（亞硝態(tài)氮近似1μg/ml）的標(biāo)準(zhǔn)液。2.0.1mol/LpH7.5的磷酸緩沖液：K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000ml。3.1%（W/V）對-氨基苯磺酸溶液：稱取10.0g加入250ml濃HCl中，用蒸餾水定容至1000ml。4.0.2%（W/V）α-萘胺溶液：稱取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸餾水定容至1000ml。5.30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。6.KNO3（0.1mol/L）、異丙醇（1%V/V）、磷酸緩沖液（0.1mol/L）混合液：稱10.10gKNO3溶于1000ml0.1mol/L的磷酸緩沖液中，再加10ml異丙醇混勻。四、方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按表13-1順序加試劑，即配成0-2.0μg的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在30℃保溫箱或恒溫水浴中保溫30min，然后在540nm波長下比色。以亞硝態(tài)氮（μg）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線或建立回歸方程。表13-1

各試劑加入順序2.酶反應(yīng)和酶活性測定（1）取樣：將材料（小麥、玉米等作物葉片）洗凈，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干。在葉片中部打取直徑1cm的圓片（或剪成0.5~1.0cm2的小塊），混勻后每個樣品稱0.3g3份，放入試管并編號。（2）反應(yīng)：向各試管加入KNO3·異丙醇·磷酸緩沖液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混勻作對照。然后將所有試管置真空干燥器中接真空泵抽氣，反復(fù)幾次直至葉片沉在管底。將各試管置30℃下于黑暗處保溫30min，分別向處理管加1.0ml三氯乙酸，搖勻終止酶活性。（3）比色：將各試管靜置2min，吸取上清液2ml加入另一組試管，以對照管做參比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線做法進(jìn)行顯色測定，并計算酶活性（Nμg·g-1·h-1）。式中

C：反應(yīng)液催化產(chǎn)生的