鴨梨黑斑病鏈格孢菌的分離鑒定

鴨梨黑斑病鏈格孢菌的分離鑒定

梨果實(shí)的黑色斑點(diǎn)是一種重要的保存期疾病。果實(shí)表面上有幾乎圓形或不規(guī)則的黑色斑點(diǎn)，中間塌陷。潮濕期間，病斑表面出現(xiàn)黑色霉菌層，影響水果的質(zhì)量和商品價(jià)值。2004年我國鴨梨曾因黑斑病而被停止出口美國和加拿大。目前,世界上已報(bào)道的從梨果實(shí)上分離到的鏈格孢共有9個(gè)組,已命名的有9個(gè)種。在中國已報(bào)道的有5個(gè)種,分別是梨黑斑鏈格孢A.gaisenK.Nagano、鏈格孢A.alternata(Fr.)Keissler、細(xì)極鏈格孢A.tenuissima(Fr.)Wiltshire、鴨梨侵染鏈格孢A.yaliinficiensR.G.Roberts和A.ventricosaR.G.Roberts。其中A.gaisen既能侵染梨葉片也能侵染梨果實(shí),并產(chǎn)生寄主?；远舅亍狝K毒素,是真正的梨黑斑病病原;A.alternata和A.tenuissima為對基質(zhì)廣適性鏈格孢種,多生于植物的枯死部分或衰弱組織上;A.yaliinficiens和A.ventricosa是美國學(xué)者R.G.Roberts分別于2003年和2007年從中國出口的鴨梨果實(shí)上分離并命名的兩個(gè)新種。近幾年,對Alternaria的鑒定,除采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定外,不少學(xué)者嘗試用分子生物學(xué)的方法,如王洪凱等用5.8SrDNA及ITS區(qū)序列分析了鏈格孢的種級分類;孫霞等用RAPD方法分析了鴨梨上的Alternaria各種間的親緣關(guān)系;薛峰等對Ulocladium、Stemphylium和Alternaria的典型菌種進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析,構(gòu)建了ITS和gpd基因序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹。作者于2005年收集了河北和山東兩省部分冷庫中儲存的具Alternaria侵染癥狀的鴨梨進(jìn)行了病原菌分離和鑒定。1材料和方法1.1培養(yǎng)鏈格孢菌從河北和山東兩省部分果園的冷庫中收集到表面有黑斑癥狀的鴨梨100余個(gè),用70%酒精擦洗病健交界處及果柄表面,去除表皮,取果肉腐爛部分平鋪在帶三層濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),并取果柄靠近基部的一段縱向剖開,在濾紙上均勻擺好。置于培養(yǎng)箱中,光照和黑暗各12ue5e8h交替,25ue5e8℃下培養(yǎng)3~5天。將出現(xiàn)鏈格孢菌的培養(yǎng)皿置于實(shí)體顯微鏡50×下觀察,用解剖針挑取具有典型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的單根孢子鏈上的孢子轉(zhuǎn)接于馬鈴薯-胡蘿卜培養(yǎng)基(PCA)(馬鈴薯20ue5e8g、胡蘿卜20ue5e8g、瓊脂15ue5e8g、蒸餾水1ue5e8000ue5e8mL)平板上。將平板置于上述光照和溫度條件下培養(yǎng)5~7天。1.2材料的分離和鑒定分別挑取上述菌落的單個(gè)孢子,轉(zhuǎn)入馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基(PCA)、1/2馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基(1/2PCA)、干草培養(yǎng)基(HAY)和V8培養(yǎng)基上培養(yǎng),在22ue5e8℃下,兩支40ue5e8W燈管(色溫4ue5e8200ue5e8K)8ue5e8h照射和16ue5e8h黑暗交替進(jìn)行培養(yǎng),燈管距離培養(yǎng)物約40ue5e8cm,培養(yǎng)物面向上,于1周后觀察。鏈格孢的培養(yǎng)特性和鑒定在上述4種培養(yǎng)基上進(jìn)行。將上述培養(yǎng)物在實(shí)體解剖鏡50×下觀察產(chǎn)孢表型組。根據(jù)Simmons等和Roberts的分組方法對分離到的Alternaria菌株進(jìn)行分組。分組后,取特征典型的菌株在顯微鏡下測量分生孢子大小,包括長、寬、喙長、橫縱(斜)隔膜數(shù),孢子顏色,孢子表面有無突起等。每菌株測量30個(gè)孢子,根據(jù)形態(tài)將菌株鑒定到種。1.3關(guān)于生物研究1.3.1馬鈴薯-葡萄糖生長曲線從每組產(chǎn)孢表型中分別選取3~13個(gè)菌株,進(jìn)行5.8SrDNA及ITS區(qū)序列分析和三磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)基因片段核苷酸序列測定。供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)3~5天后,從菌落邊緣取菌絲塊并進(jìn)一步切成極細(xì)的小塊,移到50ue5e8mL馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)液中,25±0.5ue5e8℃條件下?lián)u床150ue5e8r/min震蕩培養(yǎng)2天,經(jīng)濾紙抽濾菌絲,無菌水沖洗3次后,用滅菌吸水紙吸去多余的水份,置-20ue5e8℃冰箱中保存?zhèn)溆?。另從GenBank上下載22個(gè)Alternaria不同菌種的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析(表1)。1.3.2總dna提取總DNA提取采用CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)法。1.3.3pcr擴(kuò)增核糖體基因PCR反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液5ue5e8μL、2.5ue5e8mmol/LdNTP1ue5e8μL、10ue5e8mmol/L引物1ue5e8μL、Taq酶1ue5e8U、模板DNA0.1ue5e8mg,加雙蒸餾水至50ue5e8μL?？瞻讓φ詹患尤魏蜠NA模板。選用王洪凱等報(bào)道的一對引物ITS1和ITS4擴(kuò)增核糖體基因ITS1-5.8SrDNA-ITS2區(qū),正向引物ITS1序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;反向引物ITS4序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增程序:94ue5e8℃變性5ue5e8min;94ue5e8℃30ue5e8s,55ue5e8℃30ue5e8s,72ue5e8℃30ue5e8s,35個(gè)循環(huán);72ue5e8℃延伸7ue5e8min。選用Berbee等報(bào)道的一對引物gpd1和gpd2擴(kuò)增gpd基因片段,正向引物gpd1序列為5′-CAACGGCTTGGGTCGCATTG-3′;反向引物gpd2序列為5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′。擴(kuò)增程序:96ue5e8℃變性2ue5e8min;96ue5e8℃1ue5e8min,48ue5e8℃1ue5e8min,72ue5e8℃1ue5e8min,30個(gè)循環(huán);72ue5e8℃延伸10ue5e8min。1.3.4系統(tǒng)發(fā)育分析將測得的序列與GenBank下載的部分鏈格孢菌的基因序列(表1)一起,用ClustalX1.8軟件進(jìn)行比對,采用最大簡約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在最大簡約樹(樹集)搜索中,采用啟發(fā)式方法搜索最佳系統(tǒng)樹,所有特征被認(rèn)為是等權(quán)和無序的,同時(shí),在分析前排除非簡約信息位點(diǎn)。Bootstrapping用于評價(jià)各節(jié)點(diǎn)的支持率,測試中重復(fù)1ue5e8000次。1.3.5細(xì)胞培養(yǎng)和pcr檢測根據(jù)GenBank中發(fā)表的AK毒素合成酶基因序列(AccessionNo.AB015351AlternariaalternatageneforAKT1,completecds),合成了兩條引物AKT-1和AKT-2,對產(chǎn)孢表型屬A.gaisen組的5個(gè)菌株(表2)進(jìn)行PCR檢測。引物序列AK1:5′-AGCAGGAACAGCCGTATC-3′,AK2:5′-ACAGGGGCAACTTGAAAC-3′。反應(yīng)條件:95ue5e8℃5ue5e8min;95ue5e8℃15ue5e8s,50ue5e8℃45ue5e8s,72ue5e8℃45ue5e8s,35個(gè)循環(huán);72ue5e8℃延伸5ue5e8min。2結(jié)果與分析2.1形態(tài)評價(jià)2.1.1芽孢桿菌主要生長情況病菌分離純化共得到188支菌株,在控制條件下對其進(jìn)行產(chǎn)孢表型試驗(yàn)觀察。結(jié)果表明,188支菌株分屬4組產(chǎn)孢表型:A.gaisen組:菌落在V8和HAY上致密,在PCA和1/2PCA上相對稀疏,孢子鏈直立,不分枝或基本不分枝,多數(shù)孢子鏈含5~9個(gè)孢子,分生孢子短卵形或長卵形;A.alternata組:菌落在V8和HAY上致密,在PCA和1/2PCA上相對稀疏,孢子鏈短,分枝頻繁,主枝不明顯,每條分枝含5~10個(gè)孢子,分生孢子倒棍棒形、卵形;A.tenuissima組:菌落在V8上致密,在另3種培養(yǎng)基上相對稀疏,孢子鏈長,直立,不分枝或基本不分枝,多數(shù)孢子鏈含孢子10個(gè)以上,最多可達(dá)34個(gè),分生孢子倒棍棒形、長橢圓形;A.infectoria組:菌落在1/2PCA上稀疏,在另3種培養(yǎng)基上均較致密,孢子鏈直立,分枝不頻繁,主枝不明顯,每條分枝含5~10個(gè)孢子,由于孢子的假喙長,孢子鏈上的孢子之間看上去“間隔”很大,孢子倒棍棒形、卵形、長或短橢圓形。未見Brevicatenate組、A.aboresence組和A.yaliinficience組的產(chǎn)孢表型(表2)。2.1.2alternria屬種形態(tài)觀察產(chǎn)孢表型后,從每個(gè)產(chǎn)孢表型組中各隨機(jī)選取3~13支菌株,共32支,觀察分生孢子形態(tài),測量分生孢子大小。結(jié)果表明,A.gaisen組和A.alternata組菌株的分生孢子形態(tài)和大小基本一致,多為卵形或倒棍棒形,褐色至黃褐色,多數(shù)表面光滑,少數(shù)有微刺。詳見表3。根據(jù)Simmons等和張?zhí)煊顚lternaria屬種形態(tài)的描述,將A.alternata、A.tenuissima和A.infectoria組的菌株分別鑒定為Alternariaalternata(Fr.)Keissler、Alternariatenuissima(Fr.)Wiltshire和AlternariainfectoriaE.G.Simmons。A.gaisen組的5支菌株,產(chǎn)孢表型雖具有Alternariagaisen的特征,但分生孢子形態(tài)與A.gaisen明顯不同,而與A.alternata一致,因此尚不能定種。2.2生物鑒定2.2.1實(shí)行時(shí)間和關(guān)系:清正產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)育通過測定32個(gè)供試菌株的部分ITS區(qū)序列,結(jié)合從GenBank中下載的20條序列,用PAUP4.0b10軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,構(gòu)建最大簡約樹(圖1)。在521個(gè)堿基中,共有56個(gè)簡約信息位點(diǎn)。簡約樹步長為97,一致性指數(shù)CI=0.7938,保留指數(shù)RI=0.9078(排除非簡約信息位點(diǎn))。ITS最大簡約樹顯示,所有待測菌株與已知小孢子種A.alternata、A.tenuissima、A.longipes、A.pomicola和A.gaisen構(gòu)成了一個(gè)穩(wěn)定的分支,與其它分枝發(fā)生明顯的分化,說明待測菌與小孢子種之間的親緣關(guān)系很近。32個(gè)供試菌株的gpd序列包括612個(gè)堿基,共432個(gè)簡約信息位點(diǎn)。簡約樹步長1ue5e8279,一致性指數(shù)CI=0.6208,保留指數(shù)RI=0.7174(排除非簡約信息位點(diǎn))。gpd最大簡約樹顯示絕大多數(shù)待測菌株與已知小孢子種A.alternata、A.tenuissima、A.longipes、A.mali和A.gaisen之間獲得了95%Bootstrap的支持(圖2)。該結(jié)果與ITS序列分析結(jié)果基本一致。從上述系統(tǒng)發(fā)育分析可以看出,Alternaria大孢子種彼此間及大孢子種與小孢子種間已發(fā)生明顯分化,可以根據(jù)ITS和gpd序列差異明確區(qū)分。而供試的多數(shù)小孢子種在ITS和gpd序列上差異很小,因而無法區(qū)分。2.2.2檢測的試驗(yàn)結(jié)果兩條引物對A.gaisen組菌株的PCR結(jié)果均為陰性,而陽性對照為陽性,這說明被檢測的菌株中沒有梨黑斑鏈格孢AlternariagaisenK.Nagano。3sacdv1細(xì)胞中ak毒素基因檢測結(jié)果本研究從有腐爛癥狀的鴨梨果實(shí)上分離到3個(gè)鏈格孢種,其中細(xì)極鏈格孢A.tenuissima和鏈格孢A.alternaria,分別占54.8%和41%;侵染鏈格孢A.infectoria占1.6%。這些鏈格孢均為腐生真菌,多生于植物的枯死部分和衰弱瀕死的組織或土壤中,對梨果實(shí)的致病機(jī)制和過程以及在致病過程中的作用還有待進(jìn)一步明確。本研究從腐爛的鴨梨果實(shí)上分離到A.infectoria,該真菌過去在我國沒有侵染梨的記錄,僅陳偉群從陜西的馬鈴薯和李若瑜從人眼病組織上分離到。另外,Simmons等1993年也曾從美國的梨上分離到A.infectoria。梨黑斑鏈格孢Alternariagaisen可產(chǎn)生AK毒素。在形態(tài)學(xué)研究過程中有5支菌株具有A.gaisen組的產(chǎn)孢表型,但其孢子形態(tài)與A.gaisen不同,而與A.alternata一致,AK毒素基因檢測結(jié)果也不支持其是梨黑斑鏈格孢A.gaisen,對這幾支菌株還需進(jìn)一步觀察。本研究ITS分析結(jié)果顯示,除A.Infectoria以外的所有小孢子種和待測菌株構(gòu)成了一個(gè)獲得95%(bootstrap)支持的穩(wěn)定分支,說明這些種的親緣關(guān)系很近,而A.brassiciae、A.brassisicola、A.solani、A.sesamicola、A.zinniae這些大孢子種和A.infectoria以及外群Stemphyliumbotryosum構(gòu)成了一個(gè)87%(bootstrap)支持的分支,從系統(tǒng)樹上顯示與小孢子種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這一結(jié)果與王洪凱等對鏈格孢種級分類的分析結(jié)果一致。A.infectoria雖是小孢子種,但與其它小孢子種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),而與大孢子種A.solani、A.sesamicola和A.zinniae形成了一個(gè)99%的穩(wěn)定分支,但在形態(tài)上與A.infectoria一致的3支菌株SDYP-Y005-050608、HBYP-M060-04和HBYP-M186-04在ITS和gpd分析中均顯示與A.infectoria的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步澄清。gpd分析結(jié)果與ITS基本一致,但形態(tài)學(xué)研究被鑒定為A.tenuissima的SDYP-M026-04,在gpd分析中顯示與大孢子種的親緣關(guān)系較近,這不僅與形態(tài)鑒定結(jié)果不符,也與ITS分析結(jié)果不一致,究其原因,可能是系統(tǒng)樹構(gòu)建過程中的誤差,也可能是試驗(yàn)或分析過程中偶然的誤差所致,有待進(jìn)一步研究。國內(nèi)外許多學(xué)者用分子系統(tǒng)學(xué)方法進(jìn)行Alternaria小孢子種的分類研究,都取得了相似的結(jié)果,即形態(tài)差異明顯的種