腦卒中后抑郁大鼠模型的建立

腦卒中后抑郁大鼠模型的建立

0腦卒中后抑郁現(xiàn)狀中風(fēng)后抑郁是腦血管疾病的常見疾病，降低了腦血管患者的生活質(zhì)量，延遲了患者的神經(jīng)功能恢復(fù)，增加了社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)。目前,腦卒中后抑郁已成為腦血管病常見并發(fā)癥的治療和研究熱點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)腦卒中后抑郁研究都集中在臨床方面,有關(guān)流行病學(xué),分型診斷,危險(xiǎn)因素防治,治療和護(hù)理等方面有較大進(jìn)展,但腦卒中后抑郁基礎(chǔ)研究相當(dāng)薄弱,有關(guān)腦卒中后抑郁動(dòng)物模型研究更是少見,本文在國內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上綜合了腦卒中、孤養(yǎng)和應(yīng)激處理因素復(fù)合制備腦卒中后抑郁大鼠模型。1應(yīng)激評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。單位:成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。材料:實(shí)驗(yàn)于2002-07/2003-02在成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。選用雄性SD大鼠,體質(zhì)量350～500g,SPF級(jí)動(dòng)物。由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證:川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第7號(hào))。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)和被動(dòng)躲避實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)篩選,將積分相近的45只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、單純腦卒中組10只、孤養(yǎng)應(yīng)激組10只、腦卒中后抑郁組15只。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為第一作者,資料收集為第二作者,實(shí)施為第二、四作者,評(píng)估為第三作者,評(píng)估采用盲法,參加過正規(guī)培訓(xùn)。方法:線栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型:35g/L水合氯醛(10mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉,線栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型。腦卒中后抑郁大鼠模型的復(fù)合制備:局灶性腦缺血大鼠清醒后移入小鼠籠內(nèi)進(jìn)行16d孤養(yǎng),在術(shù)后1周相繼給予7d的中度不可預(yù)測應(yīng)激處理。應(yīng)激因素包括:電擊腳底,寒冷刺激,熱刺激,搖晃,夾尾,禁水、禁食,晝夜顛倒。以達(dá)到復(fù)合制備出腦卒中后抑郁大鼠模型。指標(biāo)觀測與方法:一般狀況觀察:每天觀察各組大鼠的精神狀況;進(jìn)食、飲水情況;大便質(zhì)地;頸部切口是否有化膿現(xiàn)象、栓線是否脫落;是否有死亡大鼠,記錄死亡時(shí)間并作尸體解剖以查明死因。每周復(fù)測一次體質(zhì)量。局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)定:(1)Longa5分法:大鼠神經(jīng)功能缺陷用量化的分級(jí)方法予以評(píng)定。0分:無神經(jīng)功能缺失癥狀,活動(dòng)正常者;1分:不能伸展對(duì)側(cè)前爪者;2分:爬行時(shí)出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈者;3分:行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒者;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失者。評(píng)定時(shí)間點(diǎn):腦卒中大鼠清醒后第4,8,24小時(shí)。(2)水平木棒實(shí)驗(yàn):一根呈水平放置的圓木棒上,固定于離地面50cm高度,地面鋪以高度為10cm的海綿墊。正常大鼠放置其上可以在上面持續(xù)時(shí)間超過3min。評(píng)定時(shí)間點(diǎn):腦卒中后第1,3,5天。大鼠行為學(xué)觀察:(1)糖水消耗實(shí)驗(yàn):所有大鼠首先訓(xùn)練飲用10g/L蔗糖水,即在開始的48h內(nèi)用10g/L蔗糖水代替自來水,接著禁水禁食20h,然后給予10g/L蔗糖水飲用并計(jì)算24h的飲用量。評(píng)定時(shí)間點(diǎn):腦卒中后第15天(復(fù)合造模后第1天)。(2)敞箱實(shí)驗(yàn):評(píng)定大鼠在5min內(nèi)的活動(dòng)情況。評(píng)定指標(biāo):中央格內(nèi)停留的時(shí)間。方格間穿行次數(shù):3只爪以上跨入鄰格的次數(shù)。豎起修飾次數(shù):兩前肢離地1cm以上的次數(shù)。評(píng)定時(shí)間點(diǎn):腦卒中后第15天。(3)被動(dòng)躲避缺陷實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)操作時(shí),將大鼠放入暗室,則大鼠將遭受電擊后逃至明室。當(dāng)大鼠再次重新回到暗室時(shí),將再次受到電擊,此時(shí)記錄數(shù)為1次,直至大鼠連續(xù)在另一端呆上2min或遭受電擊達(dá)20次,記錄此時(shí)大鼠遭受電擊的總次數(shù)及其總的被電擊持續(xù)時(shí)間。評(píng)定時(shí)間點(diǎn):腦卒中后第16天。大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺)測定:在腦卒中后第17天,處死大鼠,取出整個(gè)腦組織。按熒光分光度法測定右側(cè)額頂皮質(zhì)、左側(cè)額頂皮質(zhì)和腦干單胺遞質(zhì)水平。主要觀察指標(biāo):(1)Longa5分法評(píng)分,水平木棒實(shí)驗(yàn)停留時(shí)間。(2)糖水消耗量。敞箱實(shí)驗(yàn)中央格內(nèi)停留的時(shí)間、方格間穿行次數(shù)、豎起修飾次數(shù)。被動(dòng)躲避缺陷實(shí)驗(yàn):被電擊次數(shù)、被電擊持續(xù)時(shí)間。(3)大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:由第二作者用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。組間數(shù)據(jù)比較和自身前后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較:若符合正態(tài)分布采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析兩兩樣本比較,其中方差齊性者采用LSD法檢驗(yàn),方差不齊者采用Dunnett’s法檢驗(yàn)。個(gè)別不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。左右側(cè)額頂皮質(zhì)單胺遞質(zhì)含量比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1各組大鼠死亡及模型2.2各組大鼠體重變化2.3純腦卒中組和抑郁組一般資料評(píng)分比較因手術(shù)中死亡3只,共有腦卒中動(dòng)物22只(包括單純腦卒中組9只,腦卒中后抑郁組13只),其清醒后第4,8,24小時(shí)的評(píng)分分別為2.58±0.69,2.32±0.58,1.37±0.60。2.4腦中風(fēng)后抑郁大鼠的手術(shù)結(jié)果2.4.2開箱試驗(yàn)的結(jié)果2.4.3各組大鼠被動(dòng)逃避試驗(yàn)的結(jié)果2.5各組均甲醇含量測定結(jié)果2.6各組大鼠腦中5-羥色胺含量的測定結(jié)果2.7各組腦中氨基酸含量測定結(jié)果3孤養(yǎng)應(yīng)激復(fù)合造模技術(shù)本實(shí)驗(yàn)采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備局灶性腦缺血模型,Longa5分法顯示腦卒中大鼠在24h內(nèi)出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能缺陷,水平木棒實(shí)驗(yàn)顯示腦卒中大鼠在3d內(nèi)出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能缺陷,這從體征上證實(shí)了實(shí)驗(yàn)性腦卒中的發(fā)生。腦卒中后體質(zhì)量的降低,可能與單純腦卒中后引起的“抑郁心境”導(dǎo)致飲食下降、體質(zhì)量減輕有關(guān)。這在一定程度上反映腦卒中大鼠的自發(fā)活動(dòng)和探究活動(dòng)的減少,對(duì)周圍新鮮環(huán)境的好奇感下降,可認(rèn)為是腦卒中后抑郁行為學(xué)表現(xiàn)之一。腦卒中大鼠在腦卒中后第16天出現(xiàn)被動(dòng)躲避缺陷,這與Kato報(bào)道的腦卒中后抑郁大鼠出現(xiàn)被動(dòng)躲避缺陷相似,故亦可認(rèn)為是腦卒中后抑郁的表現(xiàn)之一。大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死后可引起缺血側(cè)投射通路的中斷,“逆行性潰變機(jī)制”可引起腦干的單胺類神經(jīng)元出現(xiàn)繼發(fā)性改變,故缺血側(cè)、未缺血側(cè)皮質(zhì)和腦干都出現(xiàn)了去甲腎上腺素含量的下降。如MR和病理觀察證實(shí)一側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死大鼠在非缺血區(qū)的患側(cè)黑質(zhì)出現(xiàn)高信號(hào)改變和病理性退行性改變,考慮為紋狀體缺血損傷后突觸間神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的失抑制所致。示:多巴胺能神經(jīng)元位于中腦黑質(zhì),若黑質(zhì)出現(xiàn)繼發(fā)性的缺血改變則可能導(dǎo)致皮質(zhì)和腦干的多巴胺含量的下降。而藍(lán)斑核(去甲腎上腺素能神經(jīng)元聚集區(qū))和中縫核(5-羥色胺能神經(jīng)元聚集區(qū))都位于腦干,可能也存在類似的遲發(fā)性改變,但此假設(shè)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。人類腦卒中后抑郁發(fā)病的“原發(fā)性內(nèi)源性機(jī)制”學(xué)說的基礎(chǔ)--單胺類神經(jīng)遞質(zhì)降低在本實(shí)驗(yàn)?zāi)X卒中大鼠得到了較好的復(fù)制,由此而產(chǎn)生的部分行為學(xué)改變亦可用該學(xué)說進(jìn)行解釋推論。有作者發(fā)現(xiàn)將群居習(xí)性的幼年大鼠在斷乳之前與母鼠分開單獨(dú)喂養(yǎng),剝奪其社會(huì)交流或母子之間的情感交流,孤養(yǎng)10～12個(gè)月后大鼠會(huì)出現(xiàn)活動(dòng)增多、殺鼠等異常行為。其機(jī)制涉及5-羥色胺能作用異常,而抗抑郁藥物可選擇性對(duì)抗活動(dòng)過多。故單純孤養(yǎng)可以作為普通抑郁癥大鼠的造模處理因素。復(fù)合造模中孤養(yǎng)時(shí)間明顯短于單純孤養(yǎng)制備抑郁模型所需時(shí)間,可能是孤養(yǎng)處理易化了腦卒中大鼠腦卒中后抑郁的發(fā)生。這與人類腦卒中后抑郁的發(fā)生相似,即大鼠在腦卒中后進(jìn)入孤養(yǎng)的環(huán)境,模擬出腦卒中患者失去社會(huì)和家庭支持和交流的狀況,故促進(jìn)或誘發(fā)腦卒中后抑郁的發(fā)生。對(duì)大鼠進(jìn)行慢性不可預(yù)知的應(yīng)激:電擊、禁水、禁食、寒冷刺激、夾尾、單獨(dú)飼養(yǎng)/密集飼養(yǎng)等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)大鼠在敞箱中的活動(dòng)次數(shù)顯著減少,對(duì)外界刺激的急性反應(yīng)性下降,血漿皮質(zhì)醇濃度升高。將應(yīng)激強(qiáng)度減輕,利用長期溫和應(yīng)激刺激,使之更現(xiàn)實(shí)地模擬生活應(yīng)激事件。利用大鼠對(duì)蔗糖水嗜好特點(diǎn)模擬人類的興趣感,并將其作為是否發(fā)生抑郁的觀測指標(biāo)。結(jié)果在應(yīng)激處理后(至少2周)大鼠出現(xiàn)蔗糖水飲用量下降,反應(yīng)出內(nèi)源性抑郁核心癥狀--快感缺失。孤養(yǎng)應(yīng)激大鼠糖水消耗量顯著降低;敞箱實(shí)驗(yàn)中央格停留時(shí)間顯著延長和方格間穿行次數(shù)顯著下降;雙側(cè)額頂皮質(zhì)和腦干的去甲腎上腺素和5-羥色胺顯著性下降,多巴胺有下降的趨勢(shì)。這說明短期中度的孤養(yǎng)應(yīng)激復(fù)合處理后大鼠能模擬出興趣感下降、自發(fā)活動(dòng)減少、單胺類遞質(zhì)降低部分抑郁表現(xiàn)。這反映了普通抑郁癥“生物胺學(xué)說”的科學(xué)性,亦提示可以將孤養(yǎng)應(yīng)激作為腦卒中后抑郁“反應(yīng)性機(jī)制”學(xué)說的體現(xiàn),促進(jìn)或誘發(fā)腦卒中大鼠抑郁狀態(tài)的發(fā)生。本課題設(shè)計(jì)的復(fù)合制備腦卒中后抑郁大鼠方案為:線栓法制備右側(cè)局灶腦缺血大鼠模型,相繼給予孤養(yǎng)和應(yīng)激處理,制備出腦卒中后抑郁大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:復(fù)合期造模成功率79.2%,總體造模成功率為56.0%。腦卒中后抑郁大鼠體質(zhì)量顯著減輕;糖水消耗量顯著下降;被動(dòng)躲避缺陷有顯著性意義;敞箱實(shí)驗(yàn)中中央格停留時(shí)間顯著延長,方格間穿行次數(shù)、豎起修飾次數(shù)均顯著減少;雙側(cè)額頂皮質(zhì)和腦干的去甲腎上腺素和5-羥色胺顯著性下降,多巴胺有下降的趨勢(shì)。由此可見,復(fù)合造模使大鼠出現(xiàn)了較顯著的生理體征、行為學(xué)和神經(jīng)生化學(xué)改變,即模擬出了體質(zhì)量減輕、興趣感下降、自發(fā)活動(dòng)和探究性活動(dòng)減少和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)降低等人類腦卒中后抑郁表現(xiàn),體現(xiàn)了“原發(fā)性內(nèi)源性機(jī)制”學(xué)說和“反應(yīng)性機(jī)制”學(xué)說指導(dǎo)腦卒中后抑郁復(fù)合造模的正確性和可行性。結(jié)論:以頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備右側(cè)局灶性腦缺血大鼠模型,并相繼給予孤養(yǎng)和中度不可預(yù)知的應(yīng)激復(fù)合制備腦卒中后抑郁大鼠。腦卒中后抑郁大鼠出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能缺陷、體質(zhì)量持續(xù)減輕、自發(fā)活動(dòng)和探究性活動(dòng)減少、糖水消耗量降低、被動(dòng)躲避缺陷。雙側(cè)額頂皮質(zhì)和腦干去甲腎上腺素、5-羥色胺出現(xiàn)顯著性降低,腦干出現(xiàn)多巴胺降低的趨勢(shì)。提示腦卒中后抑郁大鼠模擬出了腦卒中后抑郁患者體質(zhì)量下降、興趣感減退、活動(dòng)減少和腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)降低等表現(xiàn)。說明本實(shí)驗(yàn)復(fù)合制備的腦卒中后抑郁大鼠模型思路是可行的,造模是成功的。見表1。見表2。