球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選及其應用

球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選及其應用

科貝沙林白僵尸菌作為一種重要的昆蟲存在，已被廣泛用于海防、農(nóng)業(yè)害蟲防治等疾病的預防和處理。近年來,該菌被用于防治林木種實害蟲。結果表明,此菌具有一定的應用前景。病原菌在土壤中存活時間的長短及種群數(shù)量的多少,是影響其防治持效性的關鍵。土壤是一個相對復雜的環(huán)境,病原菌受到諸多因素的影響,特別是土壤中微生物種類較多,數(shù)量較大,用常規(guī)方法較難準確地檢測出它在土壤中的含量。迄今,應用較多的是利用選擇性培養(yǎng)基快速分離和測定分生孢子。Veen等利用改良的Martin氏培養(yǎng)基成功地分離了球孢白僵菌和綠僵菌Metarrhiziumanisopliae;Doberski等利用其設計的選擇性培養(yǎng)基可使球孢白僵菌生長良好,并可用于快速鑒定;Lingg利用Heck發(fā)明的培養(yǎng)基在土壤球孢白僵菌孢子濃度大于5×102個·g-1時,回收率達50%。高步衢等報道球孢白僵菌是林木種實害蟲球果花蠅Strobilomyiaspp.的一種常見致病微生物。作者在總結前人試驗的基礎上,進一步篩選出檢測施菌土壤中球孢白僵菌分生孢子的選擇性培養(yǎng)基,并應用該培養(yǎng)基測定施菌后落葉松Larixgmelini林下球孢白僵菌的動態(tài),研究它在土壤中的防治持效性。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1試驗試劑球孢白僵菌從遼寧省西豐縣自然感病的球果花蠅越冬蛹中分離而得,菌粉由河北省隆化縣十八里汰球孢白僵菌廠生產(chǎn),含孢量為50億個·g-1。1.1.2嶺落葉松林下各施菌區(qū)和對照區(qū)土樣采自遼寧省西豐縣、黑龍江省大興安嶺落葉松林中的施菌區(qū)和對照區(qū)。感病試驗在遼寧省西豐縣德豐林場日本落葉松Larixkaempferi母樹林。1.1.3e-nb-3-甲基苯磺酸酯pcnb的合成葡萄糖、蛋白胨、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、950g·kg-1五氯硝基苯(PCNB)、高錳酸鉀、結晶紫、孟加拉紅、放線菌酮和氯霉素。1.2測試方法1.2.1生長情況的測定以不加染色劑(結晶紫)的Doberski選擇性培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,加大不同劑量的殺菌物質(zhì)硫酸銅、五氯硝基苯、高錳酸鉀及兼有抑菌作用的染色劑結晶紫和孟加拉紅,用量見表1。氯霉素、放線菌酮和硫酸銅在培養(yǎng)基冷卻到40℃時加入,其余物質(zhì)在滅菌前加入。五氯硝基苯用乙醚溶解后加入1g·kg-1吐溫80制成乳劑后加入培養(yǎng)基。稱取1g菌粉放入盛有99mL含1g·kg-1吐溫80的滅菌水中,振蕩20min,取孢子液10mL轉入90mL滅菌水中,得到5×109個·L-1的孢子稀釋液。取土樣5g放入量筒,加5×109個·L-1孢子液1mL,加水至500mL攪動懸浮液,轉至1L三角瓶中振蕩20min,在懸浮液靜止前用吸管吸取10mL轉入90mL滅菌水中得到稀釋10-3倍的土壤懸浮液,用同樣方法使之稀釋至10-4倍。將不同配方的培養(yǎng)基倒入9cm的培養(yǎng)皿中,每皿加入0.5mL的10-4倍土壤懸浮液,采用稀釋平板法檢測孢子。每處理10皿,3個重復,25℃保濕培養(yǎng),逐日觀察生長情況。9d后統(tǒng)計結果,在高倍解剖鏡下(8.2×10倍)觀察鑒別球孢白僵菌。利用篩選出的選擇性培養(yǎng)基和Doberski培養(yǎng)基作檢測球孢白僵菌的對比試驗,土壤為未施菌的落葉松林下土,稀釋方法同上,每處理10皿,6個重復,9d后檢查統(tǒng)計目標真菌及非目標真菌及細菌菌落數(shù)。1.2.2土壤稀釋法檢測林間接種感病試驗施菌量為1~500g·m-2。取林間接種感病試驗處理區(qū)和對照區(qū)的土樣,用上面篩選出來的選擇性培養(yǎng)基進行檢測。第2年及第3年仍然于第1年取樣的處理及對照區(qū)取土樣,測定球孢白僵菌在土壤中的持久性。取樣方法為用直徑為4cm的金屬采土管,取林內(nèi)落葉層下地表5cm的土樣。每樣方取土樣3個,3個重復。將每處理所取土樣混合后裝入塑料袋,帶回室內(nèi)進行測定。土壤稀釋法同上,取樣前將土壤充分攪拌均勻,取5g土樣放入1L三角瓶中,加入495mL含1g·kg-1吐溫80的滅菌水,振蕩30min,把不同土樣分別稀釋10-3,10-4和10-5倍,對照區(qū)土樣為10-3倍。低劑量土樣(1~50g·m-2)為10-4倍;高劑量土樣(100~500g·m-2)為10-5倍。每處理30皿,9d統(tǒng)計菌落數(shù),計算出每克土壤中所含的孢子數(shù)。2結果與分析2.1培養(yǎng)基結構對目標真菌的影響以Doberski選擇性培養(yǎng)基檢測落葉松林下土壤時,放線菌和細菌很少,基本不影響檢測效果,但有時非目標真菌出現(xiàn)數(shù)量較多,而且有生長較快的擴展性真菌,如毛霉和根霉等影響目標真菌的測定。為此,在該選擇性培養(yǎng)基的基本配方上加入了不同劑量的殺菌物質(zhì)及兼有抑菌作用的染色劑,結果見表1。對各處理間目標真菌的出現(xiàn)數(shù)(個·皿-1)進行協(xié)方差分析,差異極顯著(F=140.73>F0.01=7.27),各處理間非目標真菌的出現(xiàn)數(shù)也存在著極顯著差異(F=136.58>F0.01=7.27),對目標真菌及非目標真菌在各處理上出現(xiàn)數(shù)的平均值進行多重比較,結果見表2。目標真菌出現(xiàn)數(shù)較多的一組中,沒有顯著差異性的處理包括:5,1,4,6,15,12,7。其中最好為硫酸銅(1g·L-1),4,6也為硫酸銅的另外2個質(zhì)量濃度,其余為高錳酸鉀(0.03g·L-1)、孟加拉紅(0.1g·L-1)、結晶紫(0.03g·L-1)和五氯硝基苯(0.22g·L-1)。由此可見,目標真菌在硫酸銅培養(yǎng)基上出現(xiàn)率較高,說明硫酸銅對目標真菌沒有顯著影響。而高錳酸鉀和五氯硝基苯只在低質(zhì)量濃度時目標真菌出現(xiàn)數(shù)才較多,說明高錳酸鉀只在低質(zhì)量濃度下對目標真菌的影響不顯著。但從表1可知,在低質(zhì)量濃度下非目標真菌的出現(xiàn)數(shù)也多,說明這2種抑制物對目標真菌和非目標真菌的影響相關性大,不易用于選擇目標真菌。從結晶紫和孟加拉紅2種試劑看,在高質(zhì)量濃度下目標真菌出現(xiàn)率較高,而在低質(zhì)量濃度下出現(xiàn)率則較低。如果比較這2種試劑對非目標真菌的影響,可以看出,由于低質(zhì)量濃度下非目標真菌出現(xiàn)較多,而且有擴展性真菌。因此,影響目標真菌的生長,主要是由于營養(yǎng)競爭,而不是藥劑本身對目標真菌的抑制作用,因為其在高質(zhì)量濃度下都可以較好生長。從表2各處理對非目標真菌的影響可知,對非目標真菌抑制較強的處理,分別為9,6,8,5,3,其中有2個屬于硫酸銅(1g·L-1和3g·L-1),其余為高質(zhì)量濃度的五氯硝基苯(2.0g·L-1,0.67g·L-1)和高質(zhì)量濃度的高錳酸鉀(0.3g·L-1)。比較上述各處理對目標真菌的影響,高質(zhì)量濃度的五氯硝基苯和高錳酸鉀,盡管對非目標真菌有很好的抑制作用,但目標真菌也受到抑制,因此效果較差。從2種染色劑的試驗結果比較,二者對非目標真菌都有一定的作用,但效果不是很好。它對目標真菌影響也不大,它們的主要作用在于目標真菌在其上有便于快速鑒定的反應,而且改變培養(yǎng)基的顏色,易于統(tǒng)計。據(jù)報道球孢白僵菌在結晶紫培養(yǎng)基上菌落背面呈暗紫色,便于快速鑒定。但本試驗發(fā)現(xiàn),加入結晶紫的培養(yǎng)基呈紫色,整個平板都呈暗色調(diào),球孢白僵菌背面的暗紫色不太明顯;而加入孟加拉紅后,培養(yǎng)基呈粉紅色,整個平板呈亮色調(diào),球孢白僵菌背面出現(xiàn)鮮紅色,易于鑒別。此外,還發(fā)現(xiàn)寄生球果花蠅的球孢白僵菌菌株,在加有孟加拉紅的培養(yǎng)基上與菌落生長邊緣相鄰的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)一個淺色圈,菌落背面呈鮮紅色;生長后期,菌落正面的菌絲上也出現(xiàn)淺紅色,具明顯鑒別特征。根據(jù)以上分析,得出適于選擇寄生球果花蠅球孢球孢白僵菌的選擇性培養(yǎng)基為葡萄糖40g,再生蛋白胨10g,瓊脂15g,硫酸銅1g,孟加拉紅0.33g,放線菌酮0.5g,氯霉素0.5g,水1L。用上述培養(yǎng)基和Doberski培養(yǎng)基檢測落葉松林下土壤中球孢白僵菌。試驗結果見表3,其中Ⅰ為原培養(yǎng)基,Ⅱ為改良后的培養(yǎng)基。經(jīng)平均數(shù)的t檢驗,表明兩者對目標真菌的檢出率沒有顯著影響,但對非目標真菌和細菌的抑制作用差異顯著,改良后的培養(yǎng)基明顯優(yōu)于原配方。2.2球孢白匹菌芽孢含量和第2年果皮花蠅發(fā)病率的關系施菌土壤中球孢白僵菌的存活率及其對球果花蠅的感病率見表4,土壤中的球孢白僵菌孢子數(shù)的對數(shù)值和死亡率的機率值進行相關分析,呈線性相關,且具有很好的相關性。回歸方程為y=0.86+0.66x(r=0.96),說明土壤中球孢白僵菌孢子含量和第2年球果花蠅發(fā)病率呈正相關。由表4可知,土壤施菌后到第2年球果花蠅老熟幼蟲下樹前,即下一個感染高峰期,土壤中仍有一定數(shù)量的球孢白僵菌分生孢子,但數(shù)量較少,只有1年前的0.9%~2.8%。從它對球果花蠅的感病率看,當初始施菌量較大時,1年后對球果花蠅的寄生率仍可達到較高的水平(44.2%),但這樣將會明顯增加防治費用,在生產(chǎn)中很難達到如此大施菌劑量。在施菌劑量為20g·m-2時,第2年可達10.1%的感病率,雖然比對照有明顯的提高,但對第3年球果花蠅種群數(shù)量作用較小。因此,利用球孢白僵菌地面施菌防治球果花蠅,只能對當年下樹的球果花蠅有較高的感病率,對降低第2年球果花蠅的種群數(shù)量有一定作用,對第3年的種群數(shù)量作用較小。3球孢白匹菌防治果皮花蠅的注意事項研究表明球孢白僵菌防治球果花蠅的持效性與土壤中球孢白僵菌孢子數(shù)量密切相關,只有土壤中有足夠數(shù)量的球孢白僵菌才能使球果花蠅達到較高的發(fā)病率。球孢白僵菌在土壤中的動態(tài),取決于土壤條件,其分生孢子的存活與土壤含水量和溫度密切相關。利用球孢白僵菌防治球果花蠅,施菌時間在6月下旬,這時正值夏季,土壤溫度較高,濕度較大,雖然有利于球孢白僵菌對球果花蠅老熟幼蟲的侵染,但不利于球孢白僵菌的存活。6月