黑果枸杞及其制品中總花色苷含量的快速測定 pH示差法

黑果枸杞及其制品中總花色苷含量的快速測定pH示差法范圍本文件規(guī)定了黑果枸杞及其制品中總花色苷含量的快速測定——pH示差法的術(shù)語、定義、原理、試劑、材料、儀器、設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計算、結(jié)果表示和精密度。本文件適用于黑果枸杞及其制品（包括保健食品和食品，如黑果枸杞提取物、黑果枸杞片、黑果枸杞膠囊、黑果枸杞口服液、黑果枸杞顆粒沖劑等；飲料類，如黑果枸杞飲料、黑果枸杞酒等）中含量大于8.55mg/100g總花色苷的測定。其他植物源性食品（如紫皮茄子、紫薯、紫洋蔥、紫甘藍、紫白菜、大櫻桃、紫葡萄、提子、藍莓、黑樹莓、黑豆、黑藜麥、黑米等）及其制品中總花色苷的測定可參照本文件執(zhí)行。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法術(shù)語和定義3.1花色苷anthocyanins是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的具有2-苯基苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)的類黃酮。原理溶液pH不同，花色苷的存在形式也不同。在pH值很低時，其溶液呈現(xiàn)最強的紅色（花烊正離子），隨著pH值增大，花色苷的顏色將褪至無色（甲醇假堿和查爾酮），最后在高pH值時變成紫色或藍色（醌式（脫水）堿）?；ㄉ瞻l(fā)色團的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，起干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH變化。根據(jù)朗伯-比耳定律，在兩個不同的pH下，花色苷溶液的吸光度差值與花色苷的含量成正比。因此，通過兩個pH，同一波長（以花色苷最大可見吸收波長）下的吸光度差值以及在700nm處測得的用于校正略微渾濁供試液的吸光度來求得花色苷含量。5試劑和材料5.1試劑5.1.1氯化鉀：分析純。5.1.2乙酸鈉：分析純。5.1.3濃鹽酸：分析純。5.1.4無水乙醇：分析純。5.1.5實驗用水：應符合GB/T6682規(guī)定的三級水要求。5.2試劑配制5.2.1乙醇溶液（80%）的配制量取無水乙醇800mL于1000mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻。5.2.2氯化鉀緩沖溶液（0.025mol/L，pH1.0）的配制稱取1.86g氯化鉀固體（準確至±0.001g）至2000mL燒杯中，加水約980mL溶解，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至1.0±0.05后，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，混勻，定容。5.2.3乙酸鈉緩沖溶液（0.4mol/L，pH4.5）的配制稱取54.43g乙酸鈉固體（準確至±0.001g）至2000mL燒杯中，加水約960mL溶解，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5±0.05后，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，混勻，定容。6儀器和設(shè)備6.1分析天平：感量為±0.0001g和±0.001g。6.2分光光度儀：具有1cm比色皿，可在400nm~900nm范圍內(nèi)測量吸光度。6.3pH計：精度為0.01。6.4超聲波清洗機：頻率40KHz，溫度20~80℃，時間1~30min。6.5臺式離心機：最大容量56mL，轉(zhuǎn)速4000~16500r/min。6.6食物粉碎機：可將固體樣品粉碎并通過425μm（40目）篩和250μm（60目）篩。6.7勻漿分散機：處理量1~2000mL（H2O），轉(zhuǎn)速3000~25000r/min。7分析步驟7.1試樣制備7.1.1黑果枸杞鮮果制備用四分法取適量或取全部，用勻漿分散機以15000~20000r/min轉(zhuǎn)速勻漿分散20s制成勻漿后，立即用于檢測，如需加水應記錄加水量。整個檢測過程應在避光條件下進行，以下相同。7.1.2黑果枸杞干果制備除去可見雜質(zhì)后，取有代表性試樣50g~100g，用食物粉碎機粉碎后，過40目篩，混勻后立即用于檢測。7.1.3黑果枸杞片、顆粒制備用四分法取適量或取全部，取有代表性試樣25g~50g，用食物粉碎機粉碎后，過60目篩，混勻后立即用于檢測。7.1.4黑果枸杞提取物、膠囊制備膠囊需事先將內(nèi)容物倒出，然后將試樣置于能容納2~5倍試樣體積的帶蓋容器中，通過反復振搖和顛倒容器使試樣充分混勻均質(zhì)后立即用于檢測。7.1.5黑果枸杞口服液、飲料、酒等液體制品制備通過反復振搖和顛倒盛裝容器使試樣充分混勻均質(zhì)后立即用于檢測。7.2供試品溶液的制備7.2.1黑果枸杞固體、半固體試樣溶液的制備7.2.1.1稱取已處理試樣一定量（干果0.5g，鮮果勻漿1.0g，片劑、顆粒、粉1.0g，準確至±0.001g），置于150mL具塞磨口錐形瓶中，準確加入50mL提取液（濃HCl:80%乙醇溶液=3:97,v/v），密塞，稱定重量。7.2.1.2放入超聲波清洗機中于50℃超聲提取30min，每隔10min振搖1次，保持固相完全分散。7.2.1.3提取結(jié)束后冷卻至室溫，再次稱定重量，用提取液補足減失的重量，混勻。取部分提取液以8000r/min離心3min，取上清液備用。7.2.2黑果枸杞液體試樣溶液的制備7.2.2.1準確移取已處理液體試樣0.5mL~2.0mL（可依據(jù)大致花色苷含量適當調(diào)整液體試樣的取用量），置于150mL具塞磨口錐形瓶中，準確加入50mL提取液（濃HCl:80%乙醇溶液=3:97,v/v），密塞，稱定重量。7.2.2.2放入超聲波清洗機中于50℃超聲提取10min，每隔3min振搖1次，保持液相完全分散。7.2.2.3以下按“7.2.1.3”要求進行操作。7.3供試品檢測溶液的制備7.3.1黑果枸杞固體、半固體供試品檢測溶液的制備按“7.2.1”要求制備的供試品溶液先加入提取液（濃HCl:80%乙醇溶液=3:97,v/v）稀釋2~5倍（可依據(jù)大致花色苷含量的實際情況而定），再用緩沖溶液稀釋4倍，制備2份供試品檢測溶液。其中一份用氯化鉀緩沖溶液（0.025mol/L,pH1.0）稀釋（1mL供試品溶液+3mL氯化鉀緩沖溶液），另一份用乙酸鈉緩沖溶液（0.4mol/L,pH4.5）稀釋（1mL供試品溶液+3mL醋酸鈉緩沖溶液）。7.3.2黑果枸杞液體供試品檢測溶液的制備按“7.2.2”要求制備的供試品溶液直接用緩沖溶液稀釋4倍，制備2份供試品檢測溶液。以下按“7.3.1”要求進行操作。7.4測定7.4.1最大吸收波長的確定將“7.3”要求制備的2份供試品檢測溶液靜置10min后，在400nm~600nm波長之間進行全波長掃描以確定最大吸收波長。7.4.2供試品檢測溶液的測定分別在最大吸收波長和700nm波長處測定用pH1.0緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液和用pH4.5緩沖溶液稀釋的供試品檢測溶液的吸光度值。注：在700nm處測定吸光度是用于校正略微渾濁的供試品檢測溶液。但若供試品檢測溶液混濁，則先通過離心或過濾使溶液澄清后再測定，以使微小的顆粒不會吸收花色苷。8結(jié)果的計算總花色苷的含量（以矮牽牛素類成分計）的質(zhì)量分數(shù)，按公式（1）計算： (1)式中：——以矮牽牛素類成分計黑果枸杞及其制品中花色苷的含量，單位為克每百克（g/100g）；——pH1.0與pH4.5的供試品檢測溶液的吸光度差值，A=(Amaxnm-A700nm)pH1.0-(Amaxnm-A700nm)pH4.5；——矮牽牛素類成分的平均摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol），=912.3；延伸應用于紫皮茄子：647.0；紫薯：976.6；黑豆、黑藜麥、紫洋蔥：449.4；紫甘藍：977.6；紫白菜：1014.2；大櫻桃：450.7；紫葡萄：481.1；提子：487.4；藍莓：480.2；黑樹莓：450.8；黑米：451.0；——稀釋因子；——提取液總體積，單位為毫升（mL）；——矮牽牛素類成分的平均摩爾消光系數(shù)，單位為升每摩爾厘米（L/（mol·cm）），=29591；延伸應用于紫皮茄子：29000；紫薯：37844；紫洋蔥：28779；紫甘藍：36902；紫白菜：34755；大櫻桃：19803；紫葡萄：20605；提子：20606；藍莓：21620；黑樹莓：24344；黑豆：41019；黑藜麥：26900；黑米：19900；——比色皿厚度，單位為厘米（cm）；