細(xì)胞學(xué)自主實(shí)驗(yàn) 染色體核型分析

人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備及染色體核型分析09級一班3組摘要：細(xì)胞培養(yǎng)是指在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體中取出的細(xì)胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。外周血中的小淋巴細(xì)胞幾乎都處于G1期或G0期的非增殖狀態(tài)。體外培養(yǎng)時經(jīng)一定劑量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，重新進(jìn)入增殖周期，進(jìn)行有絲分裂。處于增殖期的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞經(jīng)過秋水仙素處理，可停留在分裂中期或早中期，這一時期的染色體形態(tài)為棒狀結(jié)構(gòu)，是觀察分析染色體的最佳時期實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．學(xué)習(xí)人體細(xì)胞離體培養(yǎng)的方法；2．掌握制作人染色體標(biāo)本的方法；3．觀察人類染色體的形態(tài)和染色體數(shù)目；4．熟悉染色體核型分析。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞在體外長期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，共給細(xì)胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關(guān)的生長因子；氧氣及適宜的溫度；注意調(diào)節(jié)其外環(huán)境的酸堿度（pH）與滲透壓；以及為排除細(xì)胞代謝產(chǎn)物的危害，保持良好適宜的外環(huán)境而進(jìn)行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無菌條件下進(jìn)行。外周血淋巴細(xì)胞是不能增殖的分化細(xì)胞群，在體外無菌培養(yǎng)條件下，若于培養(yǎng)基中植物凝集素(PHA)則可刺激處于G。期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，重新獲得有絲分裂的能力，經(jīng)一段時間的培養(yǎng)即可獲得大量分裂期細(xì)胞以供染色體分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通過干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成，使細(xì)胞分裂順利進(jìn)入后期而停滯于中期，從而可在短期內(nèi)積累大量最適于進(jìn)行染色體分中期分裂相。此外，秋水仙素還能使染色單體縮短、分開，使染色體呈現(xiàn)明顯形而利于辨認(rèn)與觀察。染色體標(biāo)本制備過程中有兩個重要環(huán)節(jié)，其原理是：(1)低滲處理：目的是使水分通過細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)滲入，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞染色體進(jìn)一步分散而利于分析。同時，低滲處理還可使紅細(xì)胞質(zhì)膜破裂，經(jīng)后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細(xì)胞，改善了淋巴細(xì)胞的固定質(zhì)量及標(biāo)本質(zhì)量。(2)固定：目的在于盡快使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)固定于接近存活的狀態(tài)，以便作進(jìn)一步處理，若不固定則可因細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。染色體研究中常用固定液為甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸滲透力強(qiáng)，固定迅速，但易使組織膨脹而甲醇則可使組織收縮，兩者混合使用能抵消各自的缺點(diǎn)，得到較好的固定效果。各種生物染色體的數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)都是恒定的。染色體核型或組型，指一個個體或物種的特有的染色體構(gòu)成，包括染色體數(shù)目以及每一條染色體所特有的形態(tài)特征（染色體的長度、著絲粒的位置、臂比值、隨體的有無、次級縊痕（縊痕：中期染色體染色很淺且呈狹細(xì)的部位，此處染色質(zhì)呈非螺旋化。）的數(shù)目及位置、異染色質(zhì)的分布等）。核型是物種最穩(wěn)定的性狀和標(biāo)志，通常在體細(xì)胞有絲分裂中期時進(jìn)行核型的分析鑒定，也可利用減數(shù)分裂期的染色體進(jìn)行分析鑒定。染色體核型分析就是通過對染色體標(biāo)本和其照片進(jìn)行測量、對比分析、配對、分組、排列，對各染色體的形態(tài)進(jìn)行分析。在細(xì)胞遺傳學(xué)、現(xiàn)代分類學(xué)、生物進(jìn)化和遺傳育種學(xué)等研究中，是重要的研究手段。絕對長度（μm）=放大的染色體長度÷放大倍數(shù)絕對長度＝照片長度/放大倍數(shù)相對長度（%）=每個染色體長度÷染色體組總長度×100%臂比=長臂長度÷短臂長度著絲粒指數(shù)=短臂÷該染色體長度×100%三、實(shí)驗(yàn)材料、器材、試劑1、材料人的靜脈外周血器材細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)瓶2個橡皮塞2個移液搶200uL一個、1000uL離心管2個滴管2個封條1個染色體的制備滴管5個離心管6個染缸1個載玻片8個量筒50mL、10mL（四個組共用10mL、100mL、1000mL）試劑（1）、完全RPMI-l640培養(yǎng)液，含雙抗（抗菌素：青霉素：50000U/ml，鏈霉素：50000U/ml，均用無菌生理鹽水配制。培養(yǎng)液中的終濃度均為100U/ml）和小牛血清（2）、秋水仙素溶液0.1mg/mL。（3）、PHA體外培養(yǎng)時經(jīng)一定劑量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，重新進(jìn)入增殖周期，進(jìn)行有絲分裂。10mg/mL、200uL適應(yīng)范圍100ug/L-200ug/L（4）、Carnoy固定液（體積比甲醇∶冰乙酸=3∶1）30mL甲醇和冰乙酸10mL混合(5)、1/15mol/L磷酸緩沖液pH6.81ml1mol/L標(biāo)液+14ml蒸餾水（看清化學(xué)式

NaH2PO4·）(6)、Giemsa染液Giemsa染液Giemsa原液配制：稱Giemsa粉末0.8g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為50（7）、低滲液：0.075mol/LKCl溶液(實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該會提供吧)否則用標(biāo)液1mol/L（標(biāo)液）的KCl配置7.5ml標(biāo)液+92.5ml蒸餾水（8）、5%NaHCO3用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH值（已經(jīng)調(diào)好）四、操作方法（一）藥品器皿的無菌處理1．實(shí)驗(yàn)用的所有器皿，器具都必須按規(guī)定洗凈，高壓滅菌處理備用。（二）實(shí)驗(yàn)步驟1培養(yǎng)液配制（在超靜工作臺內(nèi)無菌操作）培養(yǎng)液（已加入血清）5mL，加入PHA濃度為10mg/mL100uL（加入雙抗至最終濃度100ug/mL？）混勻（PH已調(diào)好）。2、采血取滅菌的2ml針筒，用肝素濕潤（醫(yī)院加入）。用碘酒和酒精消毒皮膚，抽取靜脈血1ml。3、接種常規(guī)消毒后，立即將滅菌小瓶，送入超凈工作臺，在火焰旁將男女血液分別滴入2個盛有5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，共2個培養(yǎng)瓶，每瓶0。5ml，蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。貼好標(biāo)簽，分別為男、女。培養(yǎng)置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)66—72小時—這個時間恰好是白細(xì)胞分裂的兩個周期（每天搖4次）秋水仙素處理在終止培養(yǎng)前4個小時加入秋水仙素，取0.1mg/mL秋水仙素液30uL加入培養(yǎng)瓶，在溫箱（37度）繼續(xù)培養(yǎng)。6、離心從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管充分吹打瓶壁，吸取培養(yǎng)物移入離心管內(nèi)，同時貼好與燒瓶對應(yīng)的標(biāo)簽，相對離心管平衡后放入離心機(jī)，離心10min（1000轉(zhuǎn)/分），吸去上清液，留下沉淀物。7、低滲處理先加入1mLmol/LKcl溶液,輕輕吹打,使細(xì)胞懸浮,然后補(bǔ)加6mLKcl溶液，放回37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置208、固定1向離心管中加入固定液2ml，輕輕吹打均勻，在室溫下放置5分鐘。9、離心2男、女離心管，1000轉(zhuǎn)/分離心10min，吸去上清液，留下沉淀物。10、固定2沿離心管壁加入新配固定液6ml，吹打均勻，室溫放置20分鐘，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸去上清液，留下沉淀物。11、固定3同上12、制片上述離心管中滴入固定液0.5毫升,用滴管小心沖打成懸液,從冰箱的冰格中或低溫冰箱中取出載玻片,每片滴加懸液1—3滴，用嘴輕輕吹散，用電吹風(fēng)吹干，或在酒精燈火焰上微微烤干13、染色Geimsa染色液染色30分鐘，然后倒去多余染液。并用蒸餾水輕輕沖洗。鏡檢待稍干后，在顯微鏡下檢查。先用低倍尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀察。15、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理人的染色體2n=46,其中22對常染色體,一對性染色體.男性是XY,女性是XX.按照染色體個體大小和著絲點(diǎn)位置,人們將46條染色體分為A,B,C,D,E,F和G等7個組。16、染色體組核型分析（1）剪貼：將染色體數(shù)目為四十六條，染色體的形態(tài)、分散度均較好的照片，PS處理（便于觀察和測量），并將染色體摳出制成圖片。（2）配對：首先目測配對，根據(jù)染色體長短和形態(tài)特征，進(jìn)行同源染色體配對，分組。（3）排列：按一定順序?qū)⒁粋€細(xì)胞內(nèi)的染色體進(jìn)行排隊(duì)、編號，并寫明A-G組號，染色體從大到小編為1-22號，性染色體單獨(dú)列為一組。排列方式有多種，一般從大到小排列；相同長度的染色體，按短臂長度排列，短臂長的在前；有特殊標(biāo)記的染色體（如隨體）可特殊排列；性染色體單獨(dú)另排或放在最后。也可將形態(tài)相同的染色體歸為一組，分成若干組，按組排列。（4）測量：利用測量工具，測量染色體的如下數(shù)據(jù)：1）

絕對長度＝照片長度/放大倍數(shù)2）

每對染色體短臂絕對長度；3）

每對染色體長臂絕對長度；4）

染色體短臂總長度；5）

染色體長臂總長度；6）

相對長度：相對長度（%）=每個染色體長度÷染色體組總長度×100%7）

臂比：臂比＝染色體長臂／染色體短臂8）臂指數(shù)：著絲點(diǎn)指數(shù)＝短臂÷該染色體長度×100%五、注意事項(xiàng)1.PHA是體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問題，因此，要考慮它的質(zhì)量和濃度。鹽水提取物一般冰凍保存的時間不宜過長，時間長了效價減低。濃度一般用1％～2％，每毫升培養(yǎng)液加0.2～0.4ml；濃度過高可能會導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集。2.培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)控制在37±0.5℃3.培養(yǎng)基的pH值應(yīng)該在7.2-7.4左右，低了細(xì)胞生長不良，高了細(xì)胞則會出現(xiàn)輕度的固縮。4.在采血接種培養(yǎng)是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和分裂。但肝素量也不應(yīng)太少，以免發(fā)生凝血或培養(yǎng)物中出現(xiàn)纖維蛋白形成的膜狀結(jié)構(gòu)。這種膜狀物一般在培養(yǎng)24小時左右出現(xiàn)，此時可在無菌條件下將它除去以免影響培養(yǎng)效果。5.無菌操作的要領(lǐng)和要求1）培養(yǎng)前準(zhǔn)備

為做好培養(yǎng)前用品的充分準(zhǔn)備工作，根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的要求收集好已消毒的所需用品，清點(diǎn)無誤后置于超凈工作臺內(nèi)，這樣可避免操作開始后由于用品不全、往反取物而增加污染機(jī)會。2）超凈工作臺消毒

打開紫外線殺菌燈照射消毒20-30分鐘，然后關(guān)閉紫外燈打開風(fēng)機(jī)，流入的空氣是經(jīng)過除菌板過濾的空氣，工作臺內(nèi)可保持無菌環(huán)境。為防止培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)液等受到紫外線照射，消毒前應(yīng)予先放在帶蓋容器內(nèi)或在操作時隨手?jǐn)y入。3）洗手

操作時因整個前臂要伸入超凈工作臺內(nèi)，所以洗手時，一定要洗刷到肘部，然后用0.2%新潔爾滅擦洗或用75%酒精棉球擦試。4）火焰消毒

在超凈工作臺無菌環(huán)境中操作時，首先要點(diǎn)燃酒精燈，此后一切操作如安裝吸管橡皮頭、打開或加蓋瓶塞、使用吸管等都要經(jīng)過火焰燒灼，或在近火焰處進(jìn)行。注意金屬器械不能在火焰上燒灼時間過長。燒過的用具都要待冷卻后再接觸細(xì)胞，否則會燒焦形成炭膜，再用時會把有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。5）操作

進(jìn)行培養(yǎng)操作時動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動增加污染機(jī)會。不能用手觸及器皿的消毒部分。如已接觸，要用火焰燒灼消毒或更換。為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理布局。原則上是右手使用方便的用品放在右側(cè)，左手使用方便的用品放在左側(cè)；酒精燈置于中央。培養(yǎng)液等不要過早開瓶，打開的培養(yǎng)液和培養(yǎng)用瓶等應(yīng)保持斜位或平放，長時間開口直立，易增加落菌機(jī)會。吸取各種用液時均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或增加混淆不同細(xì)胞的機(jī)會。6.在普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，必須將培養(yǎng)瓶口蓋緊，以免培養(yǎng)液的PH發(fā)生較大的變化。如果培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液酸化比較嚴(yán)重（培養(yǎng)液呈黃色時）將不利于細(xì)胞生長，此時可加入適量無菌的0.14%碳酸氫鈉溶液調(diào)整或再加入2～3ml培養(yǎng)液來校正。培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)控制在37℃+0.57.染色體標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因。如果淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標(biāo)本質(zhì)量不佳時，其原因可能為：=1\*GB2⑴秋水仙素處理不當(dāng)：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關(guān)系，如果處理時間太短，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少，相反，如果處理時間太長，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。=2\*GB2⑵低滲處理不當(dāng)：低滲處理細(xì)胞時間過長，細(xì)胞膜往往過早破裂，以致分裂細(xì)胞或染色體丟失；如果處理時間不足時，細(xì)胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行染色體計數(shù)分析。=3\*GB2⑶離心速度不合適：如果從培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞后進(jìn)行離心時的速度太低，細(xì)胞可能被丟失；如果細(xì)胞被低滲后離心速度過高，往往使分裂細(xì)胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標(biāo)本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。=4\*GB2⑷標(biāo)本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細(xì)胞