TNAIA 0220-2023 青貯飼料中9種真菌毒素的測定 液相色譜-質譜 質譜法

ICS65.120CCSB20

TB團 體 標 準T/NAIA0220-2023青貯飼料中9種真菌毒素的測定液相色譜-質譜/質譜法Determinationof9MycotoxinsinsilageLiquidchromatography-massspectrometry2023-08-28發(fā)布 2023-08-31實施寧夏化學分析測試協(xié)會 發(fā)布前言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由寧夏化學分析測試協(xié)會提出并歸口?；刈遄灾螀^(qū)吳忠市利通區(qū)農(nóng)業(yè)服務中心、寧夏化學分析測試協(xié)會。本文件為首次發(fā)布。PAGEPAGE1青貯飼料中9種真菌毒素的測定 液相色譜-質譜/質譜法范圍FB1FB2AFB1AFB29種真菌毒素測定的液相色譜-質譜/質譜分析方法。9農(nóng)作秸稈，其它類型青貯飼料可參考本文件。規(guī)范性引用文件（有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。原理0.1%甲酸乙腈溶液提取，經(jīng)混合凈化材料萃取凈化后，取適量上清液經(jīng)氮氣吹干后乙腈水溶液定容，經(jīng)超高效液相色譜—串聯(lián)質譜法測定，外標法定量。試劑與材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水符合GB/T6682中規(guī)定的一級水。乙腈（CH3CN）：色譜純。甲醇（CH4O）：色譜純。氯化鈉（NaCl）：分析純。無水硫酸鎂（MgSO4）：分析純。檸檬酸鈉（C6H5O7Na3）：分析純。檸檬酸二鈉鹽（C6H6Na2O7）：分析純。0.1%80%乙腈溶液（8+2，體積比）20mL80mL乙腈中混勻，加入0.1%甲酸。50%乙腈溶液（5+5，體積比）：50mL50mL乙腈中混勻。FB1（CAS116355-83-0，純度≥98FB2（CAS號116355-84-1，純度≥97.9%）、伏馬毒素FB3（CAS號136379-59-4，純度≥98.5%）、脫（CAS99.383-（CAS50722-38-8，純度≥99.015-（CAS88337-96-6，純度≥99.8）、玉米赤霉烯酮（CAS17924-92-4，純度≥99.7）AFB1（CAS1162-65-8，純度≥99.0%）AFB2（CAS7220-81-7，純度≥99.0%）。5.10 標準溶液配制：根據(jù)需要分別吸取適量9種真菌毒素標準溶液，用乙腈稀釋成1.0μg/mL混合標準溶液，-18℃下保存。儀器與設備高效液相色譜-質譜/質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。6.2 0.01g0.0001g。高速萬能粉碎機：10000r/min。振蕩器。離心機：4000r/min。渦旋混合器。氮吹儀。離心管：50mL，塑料。濾膜：0.22μm，有機相。分析步驟試樣的制備青貯飼料樣品于-18℃冷凍冰箱中保存。試驗時將青貯樣品取出，用高速萬能粉碎機粉碎，分別置于樣品袋中，-18℃冷凍備用。試樣提取與凈化稱取青貯飼料樣品2.00g（精確至0.01g）于50mL離心管，加入20.00mL提取液（5.7），40min4000r/min3min6.00mL2g無水0.5g0.5g15mL40003min3.00mL15mL1.5mL定容液（5.8）溶30s0.22μm濾膜后，上機測定。液相色譜—串聯(lián)質譜法測定液相色譜參考條件色譜柱：T3柱，100mm×2.1mm1.8μm，或性能相當者。柱溫：40℃。進樣量：2μL。1。A：水溶液（0.1%甲酸+5mmol/L乙酸銨B：甲醇（0.1%甲酸）。表1 流動相、流速及梯度洗脫參考條件時間，min流速，mL/min流動相A，%流動相B，%00.490101.00.485152.00.480206.00.4406010.00.4178311.00.4901013.00.49010質譜參考條件a）離子源：電噴霧離子源。b）掃描方式：正離子模式和負離子模式。c）5500V4500Vd）離子源溫度：550℃。霧化氣、氣簾氣、碰撞氣、輔助加熱氣均為高純氮氣，使用前應調節(jié)各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。23。表2 ESI+監(jiān)測模式分析參數(shù)名稱保留時間/min定性離子對/m/z定量離子對/m/z碰撞能量/eV伏馬毒素FB18.45722.4/334.4722.4/352.4722.4/334.45450伏馬毒素FB29.69706.4/336.51706.4/318.61706.4/336.515054伏馬毒素FB39.15706.4/336.50706.4/318.60706.4/336.505050脫氧雪腐鐮刀菌烯醇3.82297.1/249.1297.1/203.2297.1/249.116213-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇6.07339.2/203.2339.2/231.1339.2/203.2211815-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇6.07339.3/321.2339.3/137.1339.3/321.21219黃曲霉毒素B17.42313.1/285.1313.1/241.1313.1/285.13350黃曲霉毒素B27.19315.1/287.1315.1/259.1315.1/287.13540玉米赤霉烯酮9.74317.1/175.0317.1/273.0317.1/175.0-32-27色譜測定與確證液和待測樣液中毒素的響應值均應在儀器線性響應范圍內。在上述儀器條件下，伏馬毒素FB1FB23-15-B1B2的保留時間分8.45、9.69、9.15、3.82、6.07、6.07、7.42、7.19、9.74min，多反應離子監(jiān)測色譜圖A4判斷樣品中存在對應的被測物。表4定性確證相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%20%至50%10%至20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%空白試驗除不稱取試樣外，均按上述操作步驟同時進行。結果計算和表達用色譜數(shù)據(jù)處理或按式（1）計算試樣中各真菌毒素的含量，計算結果需將空白值扣除。XACSV1V3ASmV2

……（1）式中：X——試樣中真菌毒素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；A——試樣中真菌毒素的峰面積；V1——試樣中加入的提取溶液體積，單位為毫升（mL）；V2——分取溶液體積，單位為毫升（mL）；V3——定容溶液體積，單位為毫升（mL）；CS——標準工作液中真菌毒素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；AS——標準工作液中真菌毒素的峰面積；m——試樣的質量，單位為克（g）。注：測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。精密度15%。定量限和回收率定量限FB1FB2FB30.050mg/kg、黃曲霉B1B20.00100.103-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-0.50mg/kg?；厥章时痉椒ǖ奶砑訚舛群突厥章史秶姼戒汢。附錄A（資料性）9種真菌毒素標準溶液在青貯飼料基質中選擇離子監(jiān)測LC-MS圖LC-MS圖，見圖A.1。圖A.19種真菌毒素標準溶液在青貯飼料基質中選擇離子監(jiān)測LC-MS圖附錄B（資料性）青貯飼料樣品中添加濃度及回收率范圍9種真菌毒素在青貯飼料中的添加濃度及回收率范圍見表B.1。表B.1 9種真菌毒素在青貯飼料中的添加濃度及回收率范圍（%）名稱添加濃度（mg/kg）回收率范圍（%）RSD(%)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON0.573～908.41.091～1023.62.093～1051.53-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇0.587～1045.81.090～1012.62.099～1043.415-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇0.591～1003.51.093～1023.62.095～1011.8玉米赤霉烯酮0.0175～882.00.0686～1033.40.386～921.5黃曲霉毒素AFB10.00182～1024.50.0057