水通道蛋白4在大鼠腦膜炎腦水腫模型中的表達(dá)及內(nèi)化作用

水通道蛋白4在大鼠腦膜炎腦水腫模型中的表達(dá)及內(nèi)化作用

細(xì)菌腦膜（bacurose）是兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見感染疾病。炎癥引起的腦水腫可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和顱內(nèi)壓增高,危害嚴(yán)重。但是,腦膜炎患者中腦水腫的發(fā)生機(jī)制并不十分清楚。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)的發(fā)現(xiàn)為研究腦水腫的發(fā)生機(jī)制開辟了新領(lǐng)域。AQPs成員中,水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)在腦內(nèi)表達(dá)最豐富,它是一種靜水壓和滲透壓依賴的雙向水通道膜蛋白,呈極性分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞在微血管周圍形成的細(xì)胞終足膜上和在軟腦膜內(nèi)表面形成的膠質(zhì)界膜上,以及室管膜細(xì)胞的基底部等部位。有研究發(fā)現(xiàn),在肺炎鏈球菌所致的小鼠腦膜炎腦水腫模型中,腦內(nèi)AQP4表達(dá)增高,提示AQP4的表達(dá)變化與小鼠腦膜炎腦水腫的發(fā)生存在一定關(guān)系。內(nèi)化(internalization)是指在某些生理或病理?xiàng)l件下,細(xì)胞的部分胞膜、跨膜蛋白以及受體或受體-配體復(fù)合物等通過(guò)胞吞、胞飲作用進(jìn)入胞內(nèi)的過(guò)程。有研究表明,在生理和病理情況下,很多細(xì)胞膜上的通道蛋白可發(fā)生內(nèi)化,以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運(yùn)功能。那么,在大鼠腦膜炎模型中,是否也存在AQP4內(nèi)化的現(xiàn)象呢?為探討在大鼠腦膜炎的病程中,AQP4在腦水腫發(fā)生中的作用,本研究觀察幼年大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型腦內(nèi)AQP4的表達(dá)變化以及是否存在AQP4內(nèi)化的現(xiàn)象。1材料和方法1.1設(shè)感染劑及試劑B族溶血性鏈球菌(groupBhemolyticstreptococcus,GBS)菌株由重慶醫(yī)科大學(xué)病原微生物和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,小鼠抗AQP4單克隆抗體、兔抗早期內(nèi)涵體1(earlyendosomeantigen1,EEA1)多克隆抗體、小鼠抗甘露糖-6-磷酸受體(mannose-6-phosphatereceptors,MPR)單克隆抗體購(gòu)自Abcam,兔抗AQP4多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz,小鼠抗β-actin一抗購(gòu)自北京中杉,相應(yīng)熒光二抗購(gòu)自康為世紀(jì)、碧云天及北京中杉,蛋白裂解液、BCA試劑盒、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒購(gòu)自碧云天,羊抗小鼠Western二抗購(gòu)自Bio-Rad公司,其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2早期感染型B族溶血性鏈球菌菌株接種于血瓊脂糖培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,移種至血清肉湯培養(yǎng)基,生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期收菌,生理鹽水沖洗2次。紫外分光光度儀檢測(cè)菌液的濁度,調(diào)整菌液濃度為108CFU/L。1.3嘴唇型嘴唇模型的誘導(dǎo)3周齡SD大鼠34只(體質(zhì)量約50g,雌雄不限,購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),分為2組:生理鹽水(n=18)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(細(xì)菌感染組,n=16)。腦膜炎模型的誘導(dǎo)參照文獻(xiàn)的方法。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,小腦延髓池穿刺進(jìn)針,回抽50μL腦脊液(CSF)棄去,實(shí)驗(yàn)組注入GBS菌懸液50μL,生理鹽水組注入50μL無(wú)菌生理鹽水。術(shù)后置籠于室溫23℃,觀察臨床表現(xiàn)。1.4腦含水量測(cè)定接種細(xì)菌24h后迅速取腦稱量濕質(zhì)量,95℃真空干燥箱烤干至恒重,稱量得干質(zhì)量,按以下公式計(jì)算腦含水量:BWC=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。1.5腦酰胺的提取幼鼠在處死前2h經(jīng)頸外靜脈注射2%伊文思藍(lán)(EB)溶液(20mL/kg),2h后經(jīng)心灌注生理鹽水沖洗.處死后迅速取腦,按3mL/100mg腦組織加入甲酰胺,37℃恒溫水浴箱避光提取72h。提取液用N725型分光光度計(jì)(波長(zhǎng)620nm)測(cè)其光密度值[D(620)],用倍比稀釋法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,再求得腦組織EB含量。1.6小鼠抗aqp4的表達(dá)接種細(xì)菌24h后左心室灌注0.9%生理鹽水沖洗,迅速取腦,分離大腦皮質(zhì),細(xì)胞裂解液提取蛋白;BCA法測(cè)定蛋白濃度,調(diào)節(jié)蛋白濃度一致,取等量蛋白樣品(30μg),SDS電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。Western封閉液封閉1h;1∶500小鼠抗AQP4單克隆抗體4℃過(guò)夜,1∶3000HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG37℃孵育1h;1∶1000小鼠抗β-actin單克隆抗體4℃過(guò)夜,1∶3000HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG37℃孵育1h;DAB顯色。應(yīng)用QuantityOne軟件半定量分析,結(jié)果以AQP4和β-actin的比值表示。1.7傳統(tǒng)he染色、免疫熒光檢測(cè)接種細(xì)菌24h后用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,左心室灌注0.9%生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛灌流固定,取全腦,4%多聚甲醛固定過(guò)夜,30%蔗糖脫水至沉底,冰凍切片連續(xù)冠狀切片。HE染色:常規(guī)HE染色。免疫熒光檢測(cè):PBS漂洗,0.3%TritonX-100作用30min,0.1%BSA37℃封閉90min,適當(dāng)稀釋的一抗混合液4℃過(guò)夜,PBS漂洗,相應(yīng)的二抗37℃孵育90min,PBS漂洗,5%DAPI-甲醇溶液孵育5min,PBS漂洗,50%甘油封片。空白對(duì)照采用0.1%BSA代替一抗孵育。激光共焦顯微鏡(LSM510Meta,Zeiss,Oberkochen,Germany)下觀察皮質(zhì)部分并拍照。1.8統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1幼鼠感染24h后he染色表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組幼鼠接種細(xì)菌24h后,2只死亡,其余16只輕者表現(xiàn)為精神差,進(jìn)食少,運(yùn)動(dòng)減少,重者表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、嗜睡,體溫低等體征;對(duì)照組幼鼠無(wú)上述表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組感染24h后HE染色見腦膜增厚及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);對(duì)照組細(xì)胞排列整齊,形態(tài)規(guī)則,未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。2.2腦含水量測(cè)量的結(jié)果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腦含水量分別為(77.3±1.6)%、(81.4±2.3)%,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。2.3兩組間2.33、4.330.330.320.213.213.213.213.213.213.320.320.320.213.213.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.213.2135.213.213.213.213.4.323.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.323510.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.323.323.323.323.323.323.323.323.323.323.323.21310.21310.213.21310.21310.213.213.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.32對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組EB含量分別為(4.27±0.33)、(4.35±0.21)μg/g,兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.4組患者7.0的比較實(shí)驗(yàn)組AQP4表達(dá)量(57.41±7.0)%較對(duì)照組(44.49±7.45)%增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。2.5pr表達(dá)微觀表達(dá)對(duì)照組大腦皮質(zhì)中早期內(nèi)涵體標(biāo)記物EEA1及晚期內(nèi)涵體標(biāo)記物MPR表達(dá)微弱,未見明顯AQP4與EEA1或AQP4與MPR的共表達(dá);實(shí)驗(yàn)組大腦皮質(zhì)中EEA1及MPR表達(dá)增多,同時(shí)AQP4分別與EEA1和MPR共表達(dá)比例增多(圖3,表1)。3細(xì)胞毒性腦水腫的功能本研究用GBS注入幼鼠延髓小腦池,實(shí)驗(yàn)組幼鼠出現(xiàn)腦膜炎癥狀,HE染色顯示腦膜及腦實(shí)質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)腦水含量較對(duì)照組增加。因此,我們成功地用GBS誘導(dǎo)出幼鼠細(xì)菌性腦膜炎腦水腫模型。腦水腫按發(fā)生機(jī)制主要分為細(xì)胞毒性水腫(cytotoxicedema)和血管源性水腫(cytotoxicedema)兩類。本實(shí)驗(yàn)中血腦屏障通透性的檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EB含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示在GBS接種24h后誘導(dǎo)的細(xì)菌性腦膜炎的模型中腦水腫的類型以血腦屏障保持完整為特點(diǎn)的細(xì)胞毒性水腫為主。這一結(jié)論被Papadopoulos等通過(guò)電鏡觀察所證實(shí),他們發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌感染36h后形成的小鼠腦膜炎腦內(nèi)呈現(xiàn)典型的細(xì)胞毒性腦水腫的形態(tài)特征:膠質(zhì)細(xì)胞腫脹,血腦屏障完整。有研究發(fā)現(xiàn)AQP4在不同類型的腦水腫的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用不同:在細(xì)胞毒性腦水腫的發(fā)生過(guò)程中,AQP4表達(dá)增高,可促進(jìn)水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),加重細(xì)胞水腫;在血管源性的腦水腫中,AQP4則有利于細(xì)胞間隙多余水分的清除。本實(shí)驗(yàn)在腦膜炎腦水腫的發(fā)生、發(fā)展中,AQP4的表達(dá)較對(duì)照組增高。文獻(xiàn)認(rèn)為,在細(xì)胞毒性腦水腫發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,AQP4表達(dá)上調(diào)在清除細(xì)胞間過(guò)量水分的同時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞卻發(fā)生了水腫,因此,AQP4的表達(dá)增高對(duì)細(xì)胞毒性腦水腫而言是一種不利因素(maladaptationreaction)。抑制AQP4的功能將有利于減輕腦膜炎病程中出現(xiàn)的細(xì)胞毒性腦水腫。有研究顯示,在轉(zhuǎn)染AQP4的人胃腺癌細(xì)胞系(humangastricepithelial,HGT-1)中,AQP4可在組胺的作用下發(fā)生內(nèi)化。本課題組在大鼠的腦缺血模型和眼內(nèi)高壓模型中,也分別觀察到AQP4內(nèi)化的現(xiàn)象。而在腦膜炎導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生過(guò)程中,在AQP4表達(dá)增高的同時(shí)是否存在腦內(nèi)AQP4內(nèi)化的現(xiàn)象,少見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察到在腦膜炎腦水腫模型中AQP4分別與早期內(nèi)涵體標(biāo)記物EEA1和晚期內(nèi)涵體標(biāo)記物MPR共表達(dá),提示AQP4內(nèi)化進(jìn)入早期內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體。AQP4在細(xì)胞膜上的極性分布是其發(fā)揮水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有離體實(shí)驗(yàn)顯示,AQP4內(nèi)化可以