核醫(yī)學(xué)課件：實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)

實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)

ExperimentalNuclearMedicine核醫(yī)學(xué)臨床核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)診斷核醫(yī)學(xué)治療核醫(yī)學(xué)體外診斷體內(nèi)診斷內(nèi)照射近距離照射顯像核素檢查非顯像功能測(cè)定吸碘率測(cè)定腎圖放射性示蹤放射性標(biāo)記動(dòng)力學(xué)分析活化分析體外放射分析放射自顯影實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)利用核技術(shù)探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和物質(zhì)變化規(guī)律，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究，其內(nèi)容主要包括放射性示蹤、標(biāo)記、動(dòng)力學(xué)分析、體外放射分析、放射自顯影和活化分析等。體外分析(invitroassay)在體外實(shí)驗(yàn)條件下，以放射性核素或其他易于探測(cè)物質(zhì)標(biāo)記的配體(ligand)為示蹤劑，以特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，探測(cè)微量生物活性物質(zhì)（激素、蛋白質(zhì)、抗原、藥物等）的檢測(cè)技術(shù)。標(biāo)記物：放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、酶蛋白等。標(biāo)記配體：抗原、抗體、受體、配體、激素、氨基酸、微生物等。特點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)精密度好應(yīng)用面廣方法簡(jiǎn)便放射免疫分析

(radioimmunoassay,RIA)Yalow和Berson于1959年創(chuàng)立。應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原作為示蹤劑，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，對(duì)胰島素的測(cè)定獲得成功。1977年Yalow因此獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?；驹碓隗w外條件下，利用定量的放射性核素標(biāo)記的抗原（標(biāo)記抗原，*Ag）和非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)Ag、被測(cè)Ag）同時(shí)與限量的特異性抗體（Ab）進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)，通過測(cè)定放射性免疫復(fù)合物的量來計(jì)算被測(cè)Ag的濃度。*Ag與Ag免疫活性相同*Ag＋Ag>Ab*Ag＋Ag+Ab*Ag-Ab+*Ag

Ag-Ab+Ag(B)Bind(F)FreeAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456Ag濃度B%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/F2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？Ag濃度B%標(biāo)準(zhǔn)曲線操作基本步驟1.加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。2.孵育：根據(jù)不同的分析對(duì)象孵育的溫度和時(shí)間不同，一般是37℃。3.分離：選擇好的分離方法分離抗原－抗體復(fù)合物（B）和游離抗原（F）。4.測(cè)量：測(cè)量游離或結(jié)合物部分的放射性。5.數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)物濃度的計(jì)算。

實(shí)際操作中，一般要設(shè)立幾個(gè)反應(yīng)管：1．最大結(jié)合管（Bo）：標(biāo)準(zhǔn)抗原的量為0，只有標(biāo)記抗原和特異性抗體時(shí)，標(biāo)記抗原與抗體充分反應(yīng)后分離B和F，所測(cè)得的B的放射性為Bo。這是沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原與之競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合達(dá)最大值。2．非特異結(jié)合管（NSB）：標(biāo)記抗原除了要和特異性抗體結(jié)合以外，還要和一些雜質(zhì)蛋白或容器的管壁等結(jié)合，對(duì)我們的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體，在相同條件下反應(yīng)后測(cè)得的放射性。3．總放射性管（T）：反應(yīng)后不分離就直接測(cè)得的放射性就是總放射性。表示標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物和游離的標(biāo)記抗原的總放射性。4．標(biāo)準(zhǔn)管（B1~Bn）：放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，再加入相同量的標(biāo)記抗原和特異抗體。一般在反應(yīng)后分離出沉淀，測(cè)定沉淀的放射性作為B。5．樣品管（Bx）：用同劑量的樣品代替標(biāo)準(zhǔn)管中的標(biāo)準(zhǔn)抗原，在相同條件下反應(yīng)和分離，同樣取沉淀測(cè)得其放射性，就可以在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣品的濃度。1.抗體2.標(biāo)記抗原3.非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）基本試劑2、標(biāo)記抗原1）比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分?jǐn)?shù)。>95%2）半衰期足夠長(zhǎng)3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I3、非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）化學(xué)結(jié)構(gòu)：與被測(cè)物化學(xué)結(jié)構(gòu)相同化學(xué)純度：高度純化化學(xué)度量：準(zhǔn)確定量穩(wěn)定性：保持免疫活性不變分離方法雙抗體法沉淀法雙抗體法+沉淀法吸附分離法固相分離法葡萄球菌A蛋白分離法分離方法的要求分離完全、快速、重復(fù)性好。不影響免疫反應(yīng)的平衡：即是要求在分離過程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、PH值等）的影響小。操作簡(jiǎn)便，分離劑來源豐富、價(jià)廉。使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測(cè)量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。

質(zhì)控目的：1．通過對(duì)一批測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)，按照要求決定結(jié)果的取舍。2．通過對(duì)不同批測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)誤差原因，改善實(shí)驗(yàn)方法，提高檢測(cè)質(zhì)量，保證結(jié)果的可靠性。

質(zhì)量控制

(qualitycontrol,QC)質(zhì)量控制指標(biāo)

1、精密度（precision）

即可重復(fù)性2、準(zhǔn)確度（accuracy）

一般要求達(dá)到90%~110%

3、靈敏度（sensitivity）最小可測(cè)量4、特異性（specificity）

交叉反應(yīng)率5、健全性（perfectly）達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的有效程度6、穩(wěn)定性（stability）保持原有性能不變的能力ABC體外放射分析的質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)控批內(nèi)質(zhì)控批間質(zhì)控批內(nèi)精密度與偏聽偏信倚分析批間精密度與偏聽偏信倚分析尋找誤差產(chǎn)生的原因、改進(jìn)分析工作質(zhì)量對(duì)某種分析方法、試劑或試劑盒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室的分析工作質(zhì)量進(jìn)行比較向主管部門提供信息，對(duì)方法、試劑（盒）進(jìn)行改進(jìn)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)量控制工作實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控

（internalqualitycontrol，IQC）是一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部實(shí)驗(yàn)方法的質(zhì)量控制，以便在一個(gè)人的同一批或不同批實(shí)驗(yàn)中，不同操作者和不同方法之間有可比性。包括批內(nèi)質(zhì)控和批間質(zhì)控。最高結(jié)合率(B0%)一般要求在30%～50%非特異性結(jié)合率(NSB%)一般要求＜5%最低濃度管結(jié)合率和最高濃度管結(jié)合率之差要求大于30%標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸的參數(shù)要求a、b值穩(wěn)定，r＞0.99ED25、ED50與

ED75指標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)合率在25%、50%和75%時(shí)對(duì)應(yīng)的抗原濃度值，反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性，有助于批間結(jié)果的比較。質(zhì)控圖連續(xù)測(cè)定10批以上高、中、低三種已知濃度的質(zhì)控血清，求出各自的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差x±s，然后作圖。以后每次分析時(shí)均要同時(shí)測(cè)定此高、中、低質(zhì)控血清，將測(cè)定值標(biāo)在圖上。

WHO要求，在一次實(shí)驗(yàn)中有下列情況之一者，其結(jié)果應(yīng)予舍棄：①三種QCS中有一個(gè)測(cè)定值＞3s②三種QCS中在同一方向上有兩種＞2s③三種QCS均在同一方向上＞1s質(zhì)控圖實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)控

（externalqualitycontrol，EQC）目的：提高各實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)結(jié)果的可比性。方法：在權(quán)威機(jī)構(gòu)的領(lǐng)導(dǎo)下，使用相同質(zhì)控血清，按照統(tǒng)一的評(píng)價(jià)方案和方法，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室之間的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)誤差，找出原因，提出改進(jìn)方法，以提高實(shí)驗(yàn)室之間所得結(jié)果的可信性和可比性。免疫放射分析

(immunoradiometricassay，IRMA)將過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合，分離結(jié)合的標(biāo)記抗體與未結(jié)合的多余的標(biāo)記抗體，測(cè)定復(fù)合物的放射性，其活度與待測(cè)抗原的量呈正相關(guān)。Ag＋*Ab

Ag-*Ab＋*AbAg為抗原，*Ab為標(biāo)記抗體，Ag-*Ab為抗原與標(biāo)記抗體的復(fù)合物。IRMA的實(shí)驗(yàn)方法雙抗體夾心法標(biāo)記第三抗體法雙標(biāo)記抗體法生物素-親和測(cè)定系統(tǒng)IRMA的特點(diǎn)標(biāo)記物的放射性活度高反應(yīng)達(dá)到平衡快比RIA更高的靈敏度（約10～100倍）比RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍更寬比RIA的特異性更高穩(wěn)定性好目前僅能檢測(cè)大抗原B%B%擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的NSB擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的NSBIRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線IRMA和RIA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖RIA++或01IRMA+1IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測(cè)Ag的量呈負(fù)相關(guān)Ag*Ab的量與待測(cè)Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素其它體外放射分析法放射受體分析法競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合分析法放射酶學(xué)分析法放射微生物分析法放射受體分析法(radioreceptorassay,RRA)基于受體與配體的特異性結(jié)合的分析方法，其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理與放射免疫分析相似。如肽類激素受體、兒茶酚胺受體等。競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合分析法(competitiveproteinbindingassay，CPBA)不需要抗體，用血漿或其他生物組織中存在的特異結(jié)合蛋白質(zhì)作為結(jié)合劑對(duì)某些物質(zhì)進(jìn)行微量分析。如甲狀腺激素結(jié)合蛋白、皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白等。放射酶學(xué)分析法(radioenzymaticassay,REA)以特異酶作為結(jié)合劑。如蛋白激酶測(cè)定環(huán)核苷酸。放射微生物分析法(radiomicrobiologicassay)以特異微生物作為結(jié)合劑。如用某種微生物測(cè)定葉酸。非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

(chemicalluminescentimmunoassay，CLIA)利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)。化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時(shí)將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析生物發(fā)光免疫分析用酶分子代替放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的技術(shù)。應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法。結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性的檢測(cè)技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，易操作。酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)

(enzymeimmunoassay，EIA)

ELISA是用酶分子標(biāo)記抗體，進(jìn)行與IRMA相似的夾心法免疫反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后分離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計(jì)測(cè)定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。常用的酶是辣根過氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，反應(yīng)后顯黃色。酶聯(lián)免疫吸附分析法

(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)

熒光免疫分析技術(shù)

(fluorescenseimmunoassay，F(xiàn)IA)利用熒光檢測(cè)技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種非放射性免疫分析方法。主要分為以下三種類型：時(shí)間分辨熒光免疫分析熒光偏振免疫分析熒光酶免疫分析

微生物——RMA

酶——REA

受體——RRA

特異結(jié)合蛋白——CPBA

改變結(jié)合體對(duì)放射性技術(shù)Ag

Ag-Ab

RIA+Ab免疫學(xué)技術(shù)※Ag

※Ag-Ab

改變標(biāo)記物第一階段第二階段第三階段小分子半抗原聯(lián)接125I單克隆技術(shù)固相技術(shù)藥品化Kit理論與實(shí)踐上更豐富更完善的RIA1.可測(cè)物達(dá)300多種2.涉及多個(gè)臨床與基礎(chǔ)學(xué)科3.

RIA顯像4.

RIA治療

熒光—FIA—IRMA化學(xué)發(fā)光—CIA

酶—EIA放射自顯影

(Autoradiography,ARG)利用射線使感光材料感光形成潛影，經(jīng)顯影定影后形成圖像，判斷放射性示蹤劑的分布部位和數(shù)量（半定量）的技術(shù)。宏觀自顯影

(macroscopicARG)又稱大體自顯影，觀察范圍較大，分辨率低，只能供肉眼或放大鏡觀察，或根據(jù)黑度判斷示蹤劑的分布和相對(duì)數(shù)量。適用于小動(dòng)物的整體標(biāo)本，大動(dòng)物的臟器或肢體，以及層析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齒的磨片或剖面等。光學(xué)顯微鏡自顯影

(lightmicroscopicARG)借助顯微鏡進(jìn)行組織或細(xì)胞學(xué)觀察，分辨率較高，根據(jù)銀顆粒判斷示蹤劑的分布部位和數(shù)量。適用于組織切片、細(xì)胞涂片等標(biāo)本。電子顯微鏡自顯影

(electronmicroscopicARG)用于示蹤劑在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分布情況的研究，能顯示普通顯微鏡觀察不到的細(xì)微結(jié)構(gòu)與放射性核素分布的關(guān)系。適用于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，甚至大分子（DNA、RNA）上的精確定位和定量，也可觀察動(dòng)態(tài)過程。要求標(biāo)本在100nm以下的超薄切片，乳膠厚度僅相當(dāng)于銀顆粒直徑（約140nm）。感光材料類型組成溴化銀直徑（μm）厚度（μm）用途原子核乳膠溴化銀明膠0.1-0.24光鏡自顯影電鏡自顯影氚片溴化銀碘化銀明膠1.05-103H標(biāo)記化合物的宏觀自顯影X線片溴化銀碘化銀明膠2.5-3.015-30核素能量較高的宏觀自顯影放射性核素的選擇能量低、射程短、半衰期長(zhǎng)的核素。純?chǔ)律渚€核素(3H、14C、32P、35S、45Ca、59Fe)β、γ衰變核素(131I)電子俘獲衰變的核素(125I、51Cr)γ躍遷的核素(99Tcm)電子俘獲、γ躍遷核素的核素發(fā)射的俄歇電子和內(nèi)轉(zhuǎn)換電子也可形成較好的自顯影圖像。純?chǔ)蒙渚€穿透力強(qiáng)，自顯影效果差。常用放射性核素放射性示蹤技術(shù)以放射性核素或其標(biāo)記的化合物作為示蹤劑，應(yīng)用射線探測(cè)儀器，通過探測(cè)標(biāo)記在化學(xué)分子上的放射性核素發(fā)射的射線，來顯示被標(biāo)記化學(xué)分子的蹤跡，用于研究示蹤劑在生物體系或外界環(huán)境中的分布及其變化規(guī)律的一門科學(xué)。是核醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的方法學(xué)基礎(chǔ)。放射性示蹤技術(shù)的特點(diǎn)靈敏度高（-1810~

-1410g）方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確合乎生理?xiàng)l件定性、定量、定位與動(dòng)態(tài)研究相結(jié)合專業(yè)技術(shù)性強(qiáng)放射性示蹤技術(shù)類型體內(nèi)（invivo）示蹤技術(shù)臟器與組織顯像放射性核素治療功能測(cè)定體液與細(xì)胞容積測(cè)定物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)化及動(dòng)態(tài)平衡體外（invitro）示蹤技術(shù)體外放射分析細(xì)胞動(dòng)力學(xué)放射自顯影活化分析放射性核素稀釋法是將待測(cè)元素與放射性同位素示蹤劑充分混合，然后分離出一部分純凈待測(cè)樣品，測(cè)其比活度，由比活度的變化來計(jì)算出待測(cè)元素的含量?；瘜W(xué)上這種方法常用來測(cè)定不易分離組分的含量，可分為正稀釋法和反稀釋法。醫(yī)學(xué)上可用于測(cè)定血容量、全身水含量及細(xì)胞外液量等。正稀釋法也稱直接稀釋法，是將一種比活度和質(zhì)量已知的放射性核素或其標(biāo)記化合物作為標(biāo)準(zhǔn)物加到含有該放射性核素的穩(wěn)定同位素或其化合物中，混合均勻后分離提出其中的一部分，然后測(cè)其比活度，計(jì)算待測(cè)物的含量。反稀釋法是將一種質(zhì)量已知的穩(wěn)定同位素加到含有其放射性同位素的待測(cè)樣品中，混合均勻后分離提純一部分化合物，再測(cè)定其比活度，計(jì)算出待測(cè)樣品中原有放射性同位素的質(zhì)量。摻入試驗(yàn)3H-TdR摻入DNA作為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的指標(biāo)觀察細(xì)胞免疫情況；3H-TdR摻入試驗(yàn)研究細(xì)胞周期；125I-UdR摻入RNA試驗(yàn)研究腫瘤細(xì)胞增殖速度、研究各種抗腫瘤藥物作用；通過標(biāo)記不同前身物（如氨基酸、核苷酸等）研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成、結(jié)構(gòu)、